Nat Biotech：新方法可消除CRISPR-Cas的脱靶效应，实现完美基因编辑

麻省理工学院（MIT）的研究人员发现基因编辑工具CRISPR-Cas系统具有脱靶效应。近日，这个研究小组的负责人张峰教授表示，他们已经找到了影响CRISPR-Cas系统精确度的关键因素，这一发现将使该系统在人类细胞中的应用更安全。目前，这一研究发表在《自然-生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。借助这项研究，科学家可以一次性破坏多个基因，从而提高治愈人类基因缺陷疾病的几率。

CRISPR-Cas系统：革命性的基因编辑工具 但是具有脱靶效应

CRISPR-Cas系统是在大多数细菌以及古菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗病毒以及其他病原体对细菌的入侵。科学家利用CRISPR-Cas系统可以对多种细胞的特定的基因组位点上进行切割，以便插入新的遗传物质。

在需要对目的基因的功能进行破坏，或者要进行目的基因替换时都可以使用CRISPR-Cas系统。科研人员如果要进行目的基因替换，就必须在目的基因被切除后，将新基因的模板复制到基因组中。

传统的建立转基因小鼠的方法是将小片段DNA整合到小鼠胚胎干细胞中，但是其耗时长，并且效率低。这项新技术为建立转基因小鼠提供了一个更快捷更有效的途径。

Broad研究所和麻省理工学院McGovern研究院的张教授介绍说，只需要三个星期，CRISPR-Cas系统可以同时将多个基因一次性编辑完成，其还可以被应用于在实验室中建立转基因细胞系。

自从张峰教授的研究团队在今年一月首次对 CRISPR-Cas系统进行阐述后，来自世界各地超过2000个实验室已经开始使用该系统建立转基因细胞系或者转基因动物。

目前已经发现有三种类型的CRISPR-Cas系统，其中其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA（guidance RNA）为核心，即CRISPR-Cas RNA引导核酸酶（CRISPR-Cas RNA-guided nuclease，CRISPR-Cas RGN）。不过，2013年6月来自美国麻省总医院的研究者发现CRISPR-Cas RGN也存在重大的局限性，它会在基因组的非目标位置产生非必要的DNA突变，也就是脱靶效应（off-target effect），这在一定程度上阻碍了研究人员将其广泛治疗应用。

新方法解决CRISPR-Cas系统难点 可减弱甚至消除消除脱靶效应

在最新研究中，为了寻找到最佳的基因组序列，研究小组成员Patrick Hsu and David Scott建立了一个计算机模型。“每一个基因都有成百上千的位点可以进行编辑。利用计算机模型，可以识别几乎任何一个基因。该模型可以帮助研究人员寻求最佳编辑位点。”麻省理工学院脑认知研究方向的助理教授张峰解释道。

研究人员发现有两种方式可以提高序列靶向特异性。第一种就是利用计算机模型。第二种方法就是调整导向RNA序列的量。在一般情况下，减小RNA序列的量可以减弱脱靶效应，但是不利于目的基因的裂解。对于每一个序列来说，高目标效应和低脱靶效应间存在一个最优的平衡点，这是可以计算出来的。

生物化学和分子生物学教授Michael Terns说：“这项研究的意义在于它对脱靶效应进行了系统和全面地分析，并且提出了减弱甚至消除脱靶效应的几种方法。”

最新研究结果表明，增长RNA链可以提高RNA的结合效率。所以张峰教授和他的同事们对RNA片段的结构进行了优化。张峰教授说，经过优化的RNA片段包含稳定的发卡结构，能够更有效的引导Cas9发挥作用。

张峰教授团队下一步的研究计划是，进一步提高CRISPR-Cas系统的特异性，并建立用来研究大脑神经回路的细胞系和动物。通过破坏参与大脑神经回路形成和发育的基因，探究其是如何发挥作用以及在神经系统疾病中是如何受损的。

原始出处：

Patrick D Hsu, David A Scott, Joshua A Weinstein, F Ann Ran, Silvana Konermann, Vineeta Agarwala, Yinqing Li, Eli J Fine, Xuebing Wu, Ophir Shalem, Thomas J Cradick, Luciano A Marraffini, Gang Bao & Feng Zhang. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology, 21 July 2013; doi:10.1038/nbt.2647