【综述】外周血生物标志物与缺血性卒中临床预后预测的相关性研究进展

摘要：缺血性卒中是导致我国成年人神经功能障碍的主要原因,快速､及时､准确预测卒中后结局并干预治疗至关重要｡目前,对缺血性卒中预后的预测主要依靠神经影像学和临床评估,缺乏客观简便的快速预测工具｡近年来研究显示,早期测定外周血来源的生物标志物或可预测卒中患者结局,从而优化卒中管理,提高患者康复效率,改善卒中结局｡该文对外周血生物标志物与缺血性卒中临床预后预测的相关性研究进展进行了综述｡

卒中是世界范围内致死､致残的主要原因之一,其中缺血性卒中(ischemic stroke,IS)约占卒中患者总数的80%｡目前,IS的诊断和临床预后的预测主要依靠神经影像学和临床评估｡多模态神经影像学技术的分辨率不足以检测IS发生后大脑细胞和分子水平的变化,无法为预后提供更为准确可靠的信息｡生物标志物可以客观评价正常生物学过程､致病过程及对暴露或干预措施的反应,有望成为预测卒中预后可靠的新工具｡外周血来源的生物标志物具有易获得､易检测､可重复等优势,成为最具潜力的IS 临床预测工具｡此外,IS 后血-脑屏障的破坏使一些脑源性生物分子释放到外周血液循环中,进一步提高了血液来源生物标志物对IS病变过程反应的准确性｡作者从IS早期并发症预测､短期和长期神经功能预后预测､复发预测3 个方面对具有临床实践转化价值的新兴外周血相关生物标志物进行了总结｡

1 IS早期并发症预测

1. 1 IS生理病理学

急性缺血性卒中(aute ischemic stroke,AIS)发生几分钟内,血液停滞和血流动力学改变限制氧气和葡萄糖的可用性,脑细胞代谢由氧化磷酸化转为高度糖酵解,进而产生过量的乳酸｡同时,能量缺乏会诱导离子通道功能障碍,导致兴奋性神经递质谷氨酸释放｡过度激活的谷氨酸受体会增加细胞内Ca2 +､Na +和水的流入,并激活细胞中的分解代谢过程｡Ca2 +超载激活钙依赖性蛋白酶､激酶磷酸酶､内切酶等细胞死亡信号,诱发缺血核心的细胞调亡,同时产生超氧化物､一氧化氮和花生四烯酸代谢物,引起神经组织氧化应激｡受伤或垂死的细胞会释放“危险信号”,从而激活免疫系统,产生炎性反应｡缺血损伤后发生上述一系列级联反应,过程中可能会伴随早期神经功能恶化(early neurological deterioration, END)､出血性转化(hemorrhagic transformation,HT)､感染､恶性脑水肿(malignant brain edema,MBE)及癫痫等发生｡早期预测和识别上述并发症,将有助于及时进行针对性预防治疗,优化患者的个体化临床管理,改善卒中预后｡

1. 2 HT预测

IS发生后血液通过受损的血-脑屏障外渗到脑实质时会发生HT,分为症状性颅内出血(symptomatic intracranial hemorrhage, sICH)和实质血肿｡已有研究对一些能够评估血-脑屏障分解的标志物进行了探讨,如S100 钙结合蛋白B >11 . 89 pg / ml(敏感度92. 9%,特异度48. 1%)､神经元特异性烯醇化酶> 24. 05 μg / ml(敏感度23.5%,特异度94. 8%)､细胞纤连蛋白> 3. 6 μg / ml(敏感度100%,特异度60%)及参与血-脑屏障破坏的标志物如基质金属蛋白酶9(MMP-9)≥ 140 ng / ml(敏感度87%,特异度90%)､血管内皮生长因子<177. 43 pg / ml(敏感度53. 3%,特异度82. 4%)均可预测HT｡Krishnamoorthy 等研究也证实,在预测HT的生物标志物中,细胞纤连蛋白总诊断比值(诊断优势比)最高(DORpooled = 299. 253,95% CI:20. 508 ~ 4 366. 709),其次是MMP-9(DORpooled =29.571,95% CI:17. 750 ~ 49. 267)｡也有研究报道,AIS患者入院MMP-9水平升高与HT风险升高有关(r = 0. 1,P = 0. 08),但与HT发生率之间无显著相关性(P = 0. 37)｡这可能因为不同MMP表达时间具有差异性,如MMP-2 在血-脑屏障开放早期(发病后3 h内)表达,而MMP-9表达长达48 h｡报道MMP-9与HT无相关性的研究采集检测血样的时间可能并非MMP-9 最高表达水平时间｡进一步动态分析IS患者血浆MMP-9 时间特征与HT的关系可能会提高预测准确性｡Guo等研究表明,中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR)是静脉溶栓治疗后出现实质血肿[曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.833]和sICH(AUC为0. 814)的独立预测因子,最佳临界值为10. 59(静脉溶栓后12 ~ 18 h);NLR≥10. 59的IS患者实质血肿风险是NLR < 10. 59 患者的8. 50倍(OR = 8. 50,95% CI:2. 69 ~ 26. 89,P <0. 01),sICH风险是NLR < 10. 59 患者的7. 93 倍(OR = 7. 93,95% CI:2. 25 ~ 27. 99,P < 0. 05)｡NLR作为一种炎性反应参数能够更好地反应机体免疫平衡状况,在IS其他并发症中也均被提示具有预测意义｡

1. 3 MBE和END预测

MBE是指大面积脑梗死后脑水肿进展导致脑组织移位形成脑疝,影像学表现为颅内占位征象,临床表现为神经功能恶化｡针对IS后MBE评估和预测的研究主要集中在神经影像学标志物,如中线移位､净吸水量､扩散加权成像等｡有研究分析了1 039 例AIS患者静脉溶栓后2 h时或血管内血栓切除术后即刻的血清N端脑利钠肽水平,结果表明,早期血清N端脑利钠肽水平升高与接受再灌注治疗后出现MBE独立相关(OR = 1. 334,95% CI:1.020 ~ 1. 745,P = 0. 036)｡脑钠肽水平升高会增加血管内皮的通透性,使白蛋白从血管内转移到细胞间隙,增加胞内水的重吸收,导致脑水肿｡此外,脑钠肽还促进炎性细胞释放MMP-9,进而加速脑水肿｡N 端脑利钠肽是由激活的脑钠肽产生,其半衰期更长､波动更小,更适合作为MBE预测因子,或可在脑疝发生前指导渗透治疗或减压术干预｡入院时较高NLR与脑梗死患者发生MBE风险增加相关(OR = 2. 27,95% CI:1. 11 ~ 4. 62,P =0.024)｡一项纳入156 例脑梗死患者的研究表明,相较于单一NLR(AUC为0. 74)或美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分(AUC为0. 84),NLR >3. 5结合高NIHSS评分是预测IS患者并发MBE的最佳预测模型(AUC为0. 87)｡进一步探究血清标志物联合影像标志物及临床因素(如NIHSS 评分)的预测模型可能有助于提高MBE风险预测的准确性｡

END是指早期神经功能呈渐进性或阶梯型恶化,或在短期内好转后恶化,2. 2% ~ 37. 5%的AIS患者会发生END｡侧支循环障碍､卒中复发､脑水肿､HT 和癫痫是AIS 后END 的危险因素｡sICH和MBE是导致END的两个主要原因｡入院时NLR > 6. 4 的IS 患者发生END 可能性更大,NLR = 6. 4 是预测END 的最佳临界值(AUC 为0. 738,敏感度为86. 7%,特异度为54. 7%)｡一项回顾性研究结果表明,NLR预测卒中结局的准确性与年龄显著相关,患者年龄< 80 岁时,入院时NLR≥5. 9能够预测IS后不良结局[改良Rankin量表(mRS)评分> 3 分;AUC为0. 87,P = 0. 026],患者年龄≥ 80 岁,NLR未能预测(P = 0.111)｡提示卒中生物标志物在老年IS患者中的效用可能有限,进一步探究老年IS患者差异免疫应答以及可能影响治疗反应的因素将是有意义的｡

1. 4 感染预测

卒中后感染(post-stroke infection,PSI)也是IS常见并发症之一,发生于5% ~ 65%的卒中患者中｡临床医师在处理PSI 时往往面临机体耐药性和感染治疗延迟与不足两大挑战｡因此,探索PSI早期预测标志物,对感染风险高的患者进行早期筛查和临床干预,或将有助于提高患者生存率｡一项荟萃分析纳入了15 项利用NLR预测PSI的研究(6 410例卒中患者,其中876 例发生PSI),结果显示,NLR 可以作为预测PSI 的生物标志物(SMD =1. 08,95% CI:0. 78 ~ 1. 39,P < 0. 01),在预测卒中相关性肺炎方面的作用尤为明显(SMD = 0. 98,95% CI:0. 81 ~ 1. 14,P < 0. 01),但上述结果也可能是由于该荟萃分析纳入的研究大多聚焦于NLR预测卒中相关性肺炎,而预测卒中相关脓毒症､脑室炎和尿路感染的研究数据较少｡NLR对不同类型的PSI是否具有同等预测效能尚待进一步研究探讨｡单核细胞与淋巴细胞比值也是卒中相关性肺炎的独立预测因素(OR =7. 177,95% CI:1. 190 ~43. 292,P = 0.032)｡血-脑屏障损伤后,中性粒细胞､淋巴细胞､单核细胞等外周免疫细胞被招募到脑实质,进而诱导机体进入免疫抑制状态,易发生病原体入侵,造成感染｡相较于单一的炎性细胞,复合炎性细胞比值能够更好地反映全身炎性反应动态变化,在预测PSI 灵敏度和特异度方面更具代表性｡一项纳入40例IS患者(21 例发生IS相关感染)的前瞻性研究对患者血清中266 种蛋白质进行了分析,其中血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是唯一能够预测PSI风险的指标(OR =3. 68,95% CI:1. 27~ 10. 60,P = 0. 047),且相较于C 反应蛋白(CRP)能更早对PSI作出反应｡Schweizer等进行了更大样本量的队列研究(283例AIS患者的衍生队列和367例AIS患者的独立验证队列),结果表明,在IS发生后6 h内SAA水平是PSI的重要预测因子(AUC为0.76)｡发生感染的患者在急性期时可以观察到SAA浓度升高,但SAA浓度升高反映的是脑损伤急性期时的炎性反应过程还是发生感染后的炎性反应现象尚不明确,值得进一步探究｡

1. 5 癫痫预测

Abraira等[29]研究表明,较低水平肿瘤坏死因子受体1(OR = 3. 334,95% CI:1. 414 ~ 7. 864,P =0.006)和较高水平的神经细胞黏附分子(OR =2.625,95% CI:1. 271 ~ 5. 420,P = 0. 009)与卒中后癫痫独立相关｡一项纳入90 例AIS患者(4 例发生卒中后癫痫)的研究结果显示,脑损伤的血液标志物S100钙结合蛋白B､神经原纤维素､tau蛋白､胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶升高与卒中后癫痫呈正相关(当敏感度为100%时,特异度为77% ~93%),其中tau蛋白最佳检测时间为缺血事件发生48 h时,其余标志物则在3个月或更晚时｡由于该研究中癫痫患者数量过少,未能进行有意义的统计分析,上述观察结果尚待进一步扩大样本量进行验证｡

2 短期和长期神经功能预后预测

在预测IS后短期和长期神经功能预后方面许多单一生物标志物已被探索,但因其敏感度或特异度有限,尚未在临床广泛运用｡最新提出的两种复合型炎性反应指标——全身免疫炎性反应指数(systemic immune-inflammation index,SII)与全身炎性反应指数(systemic inflammation response index,SIRI)分别以中性粒细胞计数×血小板计数/淋巴细胞计数､中性粒细胞计数×淋巴细胞计数/单核细胞计数计算,能更稳定地评估炎性反应及免疫情况的平衡状态,有望指导临床实践｡SII 和SIRI 最初在癌症预测研究中被提出,旨在预测癌症患者术后的预后｡目前已有研究报道了SII和SIRI在脑血管疾病中的预测价值｡一项研究对85 154 名健康人进行了10年随访,结果表明,SII和SIRI升高会增加卒中和全因死亡风险｡Ma 等前瞻性纳入84例接受溶栓治疗的AIS患者并对其进行发病3个月后的随访,结果显示,入院SIRI > 1. 010 × 109 / L对AIS患者发病3 个月后不良结局(mRS评分>3 分)有预测价值(AUC为0. 685,95% CI:0. 546 ~0. 826,P < 0. 05)｡一项纳入234 例AIS 患者的研究表明,SII 和SIRI 与卒中严重程度(轻度与中重度卒中)呈正相关(SII 最佳截断值为1 008. 33 × 109 / L,AUC 为0. 678,95% CI:0. 608 ~ 0.748;SIRI 最佳截断值为1. 790 × 109 / L,AUC 为0.682,95% CI:0. 612 ~0. 751,均P < 0. 01),SII > 1 008. 33 × 109 / L 是AIS 患者早期(发病3 个月)功能结局不良(mRS 评分>3 分)的重要预测指标(OR = 2. 350,95% CI:1. 149 ~4. 803,P =0.019)｡一项研究纳入9 107 例AIS 患者进行发病90 d 和1 年面对面随访,结果表明,入院时较高水平SII 是AIS 患者发病90 d(HR = 2. 409,95% CI:1. 273 ~ 4. 559,P = 0. 0069)和1 年(HR =2. 209,95% CI:1. 474 ~ 3. 311,P = 0. 0001)较差神经功能结局(mRS 评分> 3 分)的独立危险因素｡该研究针对既往研究确定的影响预后免疫炎性标志物的因素调整了模型,结果仍表明SII 与AIS 患者短期和长期预后密切相关｡

IS 后的免疫炎性反应是影响患者预后的重要因素｡SII 与SIRI 作为整合多种炎性反应细胞的复合指标,可有效反映血栓形成､炎性反应和适应性免疫反应,这3 种途径均为IS 发生发展的重要机制｡目前关于SII 和SIRI 在AIS 领域的报道相对较少,且研究尚未考虑免疫炎性反应的动态变化对结局的影响,未来尚需进一步探究动态监测下SII 和SIRI的预测价值｡

3 复发预测

开发能够预测IS 复发的早期生物标志物,可以有助于预测IS 复发风险｡Puig 等分析了64 例IS患者卒中后第7 天(± 1 d)血液样本中的16 个炎性反应相关分子,结果表明,细胞间黏附分子1 水平升高与卒中复发有关(HR = 1. 03,95% CI:1. 00 ~ 1. 05,P = 0. 002)｡Castillo 等采集965 例未接受抗凝治疗的IS 患者入院时和完成1 年随访时的血浆样本,测定CRP､白细胞介素6(IL-6)､IL-10､细胞间黏附分子1､血管黏附分子1､MMP-9 和细胞纤连蛋白对复发的预测效度,分析结果显示,入院时IL-6 >5 pg/ ml和血管黏附分子1 > 1 350 ng / ml 的患者复发风险明显增加(OR = 28. 7,95% CI:14.2 ~ 58. 0;OR =4. 1,95% CI:2. 4 ~ 7. 1,均P < 0. 01)｡Zhang 等采集310 例AIS 患者发病48 h 内血清样本,并完成3 个月随访后分析发现,较高IL-37 水平与卒中复发独立相关(OR = 3. 32,95% CI:2. 03 ~ 6. 13,P <0. 01),IL-37 预测复发临界值为406. 8 pg / ml｡该研究同时检测血清中CRP 和IL-6 水平,结果表明,高水平IL-6 和CRP 与卒中复发相关,但IL-6 和CRP对卒中复发预测的准确性低于IL-37(AUC 分别为0. 641､0. 624､0. 733)｡这些结果似乎与IL-37的抗炎､调节免疫抑制等作用相矛盾,但与既往报道的脑钠肽和肝细胞生长因子对预测卒中结局的结果相似｡脑钠肽和肝细胞生长因子在卒中后均起到保护神经的作用,但脑钠肽(OR = 2. 30,95% CI:1. 32 ~ 4. 01,P = 0. 001)和肝细胞生长因子(OR =1.50,95% CI:1. 10 ~ 2. 03,P = 0.015)升高均提示不良预后｡尽管一些抗炎信号通路的激活可以在卒中后促进神经保护,但并不能避免不良的全身效应｡IL-37 升高可能是抑制炎性反应并保持促炎与抗炎反应之间动态平衡的一种补偿反应,表明了炎性反应程度的加剧,从而可预测临床预后不佳｡

IL-37 相较于其他IL 家族成员在预测复发卒中方面显示出更高的准确性｡但是,目前对于IL-37的研究均样本量较小､随访时间短且未评估卒中患者血清IL-37 水平动态变化情况,未来尚需进一步进行多中心､大样本､前瞻性研究证实｡

4 生物标志物面板

IS 具有异质性和复杂性,单一生物标志物可能无法充分反映卒中发病机制的不同方面,评估由各种卒中相关生物标志物组成的生物面板可能能够进一步提高卒中预后预测的敏感度和特异度｡近年来,高通量技术能够在不同分子水平上生成大量的数据和信息,这些多组学数据的整合使得探索生物面板对卒中的作用成为可能｡

Azurmendi Gil 等评估卒中发生后72 h 内入院的283 例AIS 患者血液样本和临床参数,通过关联规则挖掘､决策树､PanelomiX 算法创建面板｡其中,包括SAA､白细胞计数和NIHSS 评分在内的小组识别未发生感染患者的敏感度为97%,特异度为45%｡使用此面板对卒中患者入院时情况进行筛查,或可减少不必要的抗生素治疗｡

一项前瞻性研究采用酶联免疫吸附实验分析了145 例AIS 患者在发病24 h 内外周血中的12 种标志物水平,其中葡萄糖､铁蛋白､IL-6､脂质氢过氧化物和25 羟维生素D 的组合预测死亡结局的敏感度为42. 1%,特异度为96. 5%｡提示外周免疫炎性反应､代谢､氧化应激反应的激活与AIS 病死率密切相关,与之相关的生物标志物或可提高卒中不良结局预测的准确率｡Alfieri等对176 例IS患者入院24 h内的血液样本分析评估,结果表明,与免疫炎性反应､代谢､氧化和亚硝化应激途径相关的生物标志物(葡萄糖､一氧化氮代谢物､脂质氢过氧化物､25羟基维生素D､IL-6 和白细胞)预测AIS患者短期(发病后3个月)结局的敏感度为86. 2%,特异度为93. 0%｡

Li等从65种细胞因子中筛选出AIS患者和健康人之间10 种差异表达的循环炎性反应生物标志物(肿瘤坏死因子相关激活蛋白､肝细胞生长因子､IL-1β､IL-10､IL-16､IL-2､IL-5､IL-2 受体α､趋化因子配体20和MMP-1),以探究接受溶栓治疗前这10种循环炎性反应生物标志物对IS后sICH的预测价值｡该研究应用多因子免疫分析检测242 例AIS患者入院后的血液样本中上述10 个生物标志物水平,选择LASSO回归并通过五倍交叉验证,从中选择有预测效能的预测因子子集,构建多生物标志物面板｡研究结果显示,包含肿瘤坏死因子相关激活蛋白､IL-1β､IL-10､IL-16､IL-2､IL-5､IL-2 受体α､趋化因子配体20 和MMP-1 的多生物标志物组合是IS溶栓治疗后sICH的独立预测因子(AUC为0. 879)｡

在卒中前后,白细胞､血小板和受损的脑细胞与体液因子之间相互作用引起的转录变化也有望成为有潜力的预测卒中预后的生物标志物｡这些转录变化可以在编码核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)或非编码RNA的水平上观察到｡目前预测卒中预后的生物标志物包括信使RNA(messenger RNA,mRNA)､微RNA和长[链]非编码RNA｡Zuo等研究结果表明,3 种环状RNA (circFUNDC1､circPDS5B和circCDC14A)在AIS治疗7 d内的变化率组合能够预测卒中预后(AUC为0. 960)｡

5 总结与展望

基于外周血液的生物标志物可以反映卒中的病理､生理过程中的分子和生化改变,包括血管生成､代谢､炎性反应､氧化应激､凝血､血栓形成､神经胶质细胞激活以及神经元和血管损伤,可以对常规检查和神经影像学检查结果进行补充,有助于早期识别和预测卒中临床结局｡

将外周血生物标志物预测IS 临床结局应用至临床实践中仍存在挑战:(1)目前探索预测IS临床结局候选生物标志物的研究多为单中心､小样本,并且标志物临界值各不相同｡此外,对生物标志物释放的时间线及其维持促炎和抗炎反应之间动态平衡的研究较少｡了解该过程对于更好地定义生物标志物测定的时间窗口可能至关重要｡未来尚需进行多中心､大样本研究进行筛选和验证｡(2)基于血液的生物标志物可能受到高血压病､糖尿病､心房颤动､高脂血症等合并症的影响｡进一步探讨如何减少上述合并症的影响将有助于提高生物标志物在临床上的预测效度｡

虽然预测卒中预后的外周血生物标志物临床应用仍需要进行更多的研究,但相较于目前运用的卒中量表预测卒中预后的方法,外周血生物标志物可以提供患者临床状况的重要信息并在监测病情变化方面更具优势｡由于卒中患者临床特征的可变性､缺血级联反应的复杂性以及卒中表型的异质性,单一生物标志物的测定未显示出足够的敏感度和特异度｡复合炎性反应指标和多生物标志物的组合面板可能在临床诊断､预测和治疗方面更具潜力｡