Carbohydr Polym 山东大学张群业/迟连利教授团队合作揭示硫酸乙酰肝素及其结合蛋白在动脉粥样硬化中的功能及机制

由于人口老龄化加剧，存在心血管病危险因素的人群巨大，我国动脉粥样硬化的发病率逐年升高。氧化应激引起的内皮功能障碍是引发动脉粥样硬化的早期因素。作为维持内皮细胞生物学功能的屏障，内皮细胞表面糖萼富含硫酸乙酰肝素(HS)，其生物学功能也与糖和蛋白的相互作用密切相关。然而，在内皮细胞氧化应激过程中，内皮细胞糖萼的结构异常及动脉粥样硬化发生发展过程中，糖萼HS与蛋白相互作用的病理机制尚未完全阐明。

2024年1月18日，山东大学齐鲁医院心血管重构和功能研究重点实验室张群业教授及国家糖工程技术研究中心迟连利和靳岚教授共同合作在糖研究领域权威期刊Carbohydrate Polymers上在线发表了题为“Improving impact of heparan sulfate on the endothelial glycocalyx abnormalities in atherosclerosis as revealed by glycan-protein interactome”的研究论文，揭示了肝素/HS通过与AHSG相互作用发挥抗动脉粥样硬化作用的分子机制，为理解动脉粥样硬化中糖萼的重要作用提供了新的见解。

首先，研究者使用ox-LDL处理模拟生理状态下的氧化刺激，通过激光共聚焦技术对细胞表面糖萼HS进行了表征。体内体外结果均证明，内皮细胞表面HS在氧化刺激下，形态发生了变化，与正常组相比，氧化刺激组内皮细胞糖萼的HS结构更加致密。通过基于液质联用的定量和定性技术表征了氧化刺激对HS结构的影响，实验结果显示，氧化刺激后，内皮细胞表面HS分子量降低，硫酸化水平降低。

为了探究氧化刺激下HS结构变化引起的后续生物功能改变，研究者使用iTRAQ技术对内皮细胞氧化刺激前后的蛋白质组进行了定量分析，共鉴定到了超过7000个蛋白，其中包括345个差异表达蛋白。差异表达蛋白参与的生物学过程和肝素或HS密切相关，如伤口刺激调节、纤溶凝血等；另外还有许多蛋白可以直接和肝素或者HS相互作用。为了挖掘未知的HSBP，扩充现有的HSBP库，研究者使用蛋白芯片的方法获得了肝素-蛋白相互作用组的数据。通过结合已知HSBP数据库和肝素-蛋白相互作用组的结果，345个差异蛋白中的HSBP 数量被扩充到77个，其中41个是通过芯片新发现的HSBP。以上结果结合生物信息学手段初步确定了AHSG在动脉粥样硬化中的关键作用。

为了验证并阐明AHSG和肝素的相互作用机制，研究者使用了核磁滴定和氢氘交换质谱技术来分析AHSG和肝素的结合位点，使用分子对接对实验结果进行验证。实验结果证明：肝素和AHSG的结合位点是一个三维的空间域，而不是一个连续的氨基酸一级序列；并且在肝素糖链中分散分布的硫酸基团、2-O硫酸、6-O硫酸以及N-硫酸化对AHSG和肝素的结合起着重要作用。

由于肝素是一种高硫酸化的HS类似物，在临床上被广泛用作抗凝血药物。但是，肝素易引发出血副作用的特点限制了其在治疗其它疾病方面的应用。因此研究者制备了一种非抗凝肝素，并进行了后续的体内体外实验。结果表明，肝素类似物可以通过在氧化应激过程中保护HS免受降解和减少损伤部位AHSG的积累来缓解动脉粥样硬化。

综上，研究人员通过整合多种分析技术，开发了一种新策略，通过糖组学和糖胺聚糖-蛋白质相互作用组揭示了氧化刺激下内皮糖萼在动脉粥样硬化发生发展中的重要作用。利用基于液质联用的定性和定量分析技术，揭示了氧化刺激时内皮糖萼中HS结构的变化。采用iTRAQ标记定量蛋白质组技术，比较了氧化刺激对内皮细胞蛋白组学水平的影响，结合人类蛋白组芯片获得的蛋白-肝素相互作用组分析筛选出一系列受氧化刺激扰动的HSBP。通过生物信息学分析，发现AHSG是动脉粥样硬化中一种重要的HSBP。通过核磁滴定技术、基于质谱的氢氘交换技术和分子模拟对接技术互为补充鉴定了AHSG与肝素结合的结构域。体内体外实验证明，肝素类似物可以通过在氧化应激过程中保护HS免受降解和减少损伤部位AHSG的积累来缓解动脉粥样硬化。这一研究揭示了肝素/HS通过与AHSG相互作用发挥抗动脉粥样硬化作用的分子机制，为理解动脉粥样硬化中糖萼HS的重要作用提供了新的见解。

山东大学齐鲁医院心血管重构和功能研究重点实验室张群业教授及山东大学国家糖工程技术研究中心的迟连利和靳岚教授为该论文并列通讯作者。山东大学国家糖工程技术研究中心博士生陈晴晴和徐晓晖为该论文共同第一作者。该项研究获得了国家科技部重点研发计划的资助。

论文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0144861724000602?via%3Dihub