Genome Med：郑骏年/董东/支巧明团队利用长读长测序全面解析CRC中的异常选择性剪接

导读

选择性剪接（AS）是真核生物转录后调控重要机制之一，这一过程能够从单个基因产生多个RNA转录本，使蛋白质组多样化。异常AS被认为是癌症发展的一个标志，直接参与调控肿瘤发生、发展所涉及的多种生物学过程，如增殖、凋亡、肿瘤转移等，对AS进行系统性研究可能为恶性肿瘤提供潜在的生物标志物。由于系统分析的技术局限性，转录组的复杂性在很大程度上被削弱，系统地识别AS颇具挑战。

结直肠癌（CRC）是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，其死亡率较高。已有研究证据表明，CRC中存在AS改变，异常AS也与CRC癌变有关。但迄今为止，CRC的RNA剪接图谱尚未得到充分探索。因此，全面描述AS的情况及其生物学意义有助于了解AS在CRC中的重要性。此外，对新型剪接事件和潜在调控机制的分析可能为开发CRC的新治疗策略提供新的见解。

近期，徐州医科大学的郑骏年、董东和苏州大学第一附属医院支巧明团队合作，在Genome Medicine上发表了题为“Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer”的文章。研究团队使用长读长测序和短读长测序平台对CRC中的AS事件进行系统全面分析，发现了数千个未加注释的剪接异构体，其中一些新的转录本与CRC患者的生存密切相关，拓宽了人们对CRC肿瘤发生的理解。此外，新发现的剪接异构体TIMP1Δ4-5在介导CRC进展中发挥着重要作用，可能是CRC的潜在治疗靶点。

文章发表在Genome Medicine上

使用长读长和短读长测序表征CRC转录组

研究团队收集了78例CRC患者的癌组织和10例癌旁正常组织，利用ONT长读长测序平台和Illumina短读长测序平台解析CRC转录组（图1A），最终获得792万个ONT长reads，每个样本的平均reads长度为1.02 kb，为分析CRC转录组的复杂性提供了可靠和有价值的资源。

接下来，依据参考转录组（GENCODE v34），研究团队共鉴定出90,703个转录本（图1B），被定位到18,024个注释基因和2796个新基因位点，近60%的基因有两个或更多的转录本（图1C）。这些转录本主要为4种类型，37%为FSM、40%为NIC、17%为NNC以及0.2%为ISM。与当前转录组数据库相比，超62%转录本是全新的（主要为NIC和NNC）。进一步分析发现，这些新的转录本可能是样本特异性的，其能够在相对较低的水平上表达更多的外显子。

为了验证长读长测序转录本的可靠性，研究团队通过将短读长RNA-seq数据映射到长读长CRC转录组进行分析，84%的FSM转录本、71%的NIC转录本和55%的NNC转录本是有效的（图1D）。

图1.ONT测序鉴定CRC中的新转录本。

在发现的56,790个新转录本中，36,489个（64%）被归类为NNC，15,640个（27%）被归类为NIC，突出了CRC转录组的错综复杂。与NNC转录本相比，NIC具有更长的转录本。此外，研究发现，外显子的数量和新转录本的数量之间有很强的正相关，表明更高的外显子复杂性导致了转录本库的扩大。

研究显示，来自长读长测序的基因和转录本的量化与来自短读长数据高度一致。通过对具有高增益的新剪接异构体的单个基因进行通路富集分析发现，这些基因与癌症相关特征有关，如RNA剪接、TGF通路等。值得注意的是，癌基因在CRC中产生了大量新转录本，其可能在癌症发生和肿瘤进展中发挥重要作用。

图2. 长读长ONT新转录本特征。

CRC转录组中AS异常事件

研究团队使用SUPPA2软件对基于ONT长读长测序数据的AS事件进行注释，量化了7种不同类型AS事件的水平，即SE、A3、A5、AF、AL、RI和MX，共发现2,363,976例AS事件，其中AF事件占大多数。随后，研究团队对上述AS事件进行了严格筛选，最终获得1,085,182例，组成AS事件数据集。

为探究CRC中的异常AS事件，研究团队对肿瘤与癌旁正常样本之间的AS事件进行差异分析，鉴定出25,002例差异表达AS（DEAS）事件。进一步对携带DEAS事件的亲本基因进行集富集分析，发现其富集于G2/M细胞周期检查点、E1F信号通路、MYC信号通路、有丝分裂纺锤体等。特别地，不同类型的AS事件在特定通路中显著富集。此外，研究团队还确定了MYC信号通路中涉及的特定基因，这些基因在肿瘤发生过程中经历了显著的AS变化。

上述研究发现表明，在CRC中，DEAS事件可能通过与多种癌症相关途径相互作用而发挥复杂的作用。

图3.CRC中选择性剪接事件的鉴定。

与AS事件相关的临床结果

AS事件具有高度可变特征，研究团队探究了其能否作为CRC中新的预后生物标志物，使用单因素Cox分析来评估总生存率与各DEAS事件之间的相关性。结果显示，1,472个DEAS事件（共1,241个基因）与CRC患者的预后密切相关，其中，809例与预后良好相关，663例与预后较差相关。值得注意的是，38个基因被确定为良好和较差预后的AS事件，发现了对应于27个不同基因的前30个DEAS事件，这些基因与CRC的总存活率相关。上述结果表明，DEAS事件可能是有价值的CRC预后生物标志物。

图4. 识别与CRC预后相关的DEAS事件

在已鉴定的DEAS事件中，研究团队发现了许多新的剪接异构体，其可能是患者生存的重要决定因素。其中，新鉴定的剪接异构体TIMP1Δ4-5在CRC中显著下调，表明其在CRC肿瘤发生中起重要作用。进一步体外和体内实验证明，TIMP1Δ4-5的异位表达显著抑制了肿瘤细胞的生长、转移及侵袭。此外，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1（SRSF1），通过维持TIMP1Δ4-5的内含而发挥肿瘤剪接调节作用。

已有文献报道，全长TIMP1（TIMP1-FL）表达与人结直肠癌的肿瘤发生和转移相关，研究团队分别在CRC及CRC细胞系中过表达TIMP1Δ4-5和TIMP1- FL，以研究其在CRC中的单独作用。结果显示，与TIMP1Δ4-5作用相反，TIMP1- FL过表达显著提高了CRC细胞的生长、迁移能力。

图5. TIMP1Δ4-5和TIMP-FL在CRC癌变中具有相反作用

利用CRISPR/dCasRx系统诱导TIMP1外显子4-5排除的治疗策略

基于上述结果可知，介导剪接异构体从TIMP1-FL向TIMP1 Δ4-5的转换对于CRC患者的治疗是必要的。先前研究表明，dCasRx靶向选择性剪接外显子侧翼的调节剪接位点可诱导外显子跳跃，因此可利用CRISPR/dCasRx系统来操纵TIMP1基因的选择性剪接。研究团队设计了6个gRNA，将dCasRx与每个gRNA转染到SW480细胞中，在48h后使用RT-PCR进行评估。结果显示，在体外培养的CRC细胞中，CRISPR/dCasRx系统能够有效诱导TIMP1的外显子4-5的排除，进而能够显著抑制CRC细胞的增殖、生长。

研究团队通过给裸鼠皮下注射SW480细胞，进一步在体内测试了这种基于CRISPR/ dCasRx的策略，发现dCasRx介导的外显子排除显著抑制了裸鼠的肿瘤生长。综上，该研究结果证明dCasRx能够在体内和体外高效编辑RNA，靶向TIMP1选择性剪接可能成为一种有效的辅助CRC治疗新策略。

图6.靶向TIMP1选择性剪接在CRC中的治疗价值

结语

异常的AS被认为是癌症发展的标志。研究团队将长读长测序和短读长RNA-seq方法相结合，描述了人类CRC中的AS图谱，揭示了CRC的转录组复杂性。该研究是迄今为止对CRC中全长转录本和剪接异构体多样性最全面的表征，发现了大量未被注释的新转录本。此外，研究证明了癌基因和肿瘤抑制基因在CRC样本中表现出显著不同的RNA亚型多样性，揭示了可能在致癌作用中起重要作用的新转录本。值得注意的是，新发现的剪接异构体TIMP1Δ4-5在介导CRC进展中起着重要作用，可能是CRC的潜在治疗靶点。

参考资料：

Qiang Sun, Ye Han, Jianxing He, et al. Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer. Genome Medicine, 2023.

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01226-y