《自然》子刊：cfDNA噬菌体组可用于鉴定感染新方法！

一个多世纪前开发的细菌培养方法仍然是识别细菌病原体的标准护理方法。但这些方法通常不精确，改进细菌性病原体的鉴定和后续研究是一项关键的医学需求。无细胞DNA (cfDNA)的下一代测序(NGS)有望填补这一空白。血液循环中的cfDNA由DNA片段组成，通常长50-200 bp，主要来源于人类，但也具有一个小但丰富的微生物来源。

噬菌体，或称为感染细菌的病毒，可能为脓毒症和机会性感染的细菌生态学提供见解。噬菌体存在于人体的各个部位，包括皮肤和肠道。它们感染细菌种群，是人类微生物群的活跃和关键组成部分。许多噬菌体的宿主范围很窄，仅限于几种密切相关的细菌，因此，噬菌体的组成可以反映菌种和菌株水平上的细菌种群。尽管存在结构和遗传多样性，但人类体内的大多数噬菌体都是无包被DNA病毒，任何进入血液循环的噬菌体DNA都可以使用现有的NGS方法进行测序，并在cfDNA中检测到。在宏基因组数据中对噬菌体的针对性分析一直以来受到缺乏可用的噬菌体序列的限制。幸运的是，提交给NCBI基因库的基因组数量持续快速增长，随着越来越多的噬菌体基因组被了解，这有助于改进对这些噬菌体的识别。

近日，来自美国顶级院校斯坦福的研究团队在杂志Nature microbiology上发表了一篇题为“Phage diversity in cell-free DNA identifies bacterial pathogens in human sepsis cases”的文章。在这篇文章中，作者描述了一种在cfDNA中鉴定和分析DNA噬菌体序列的方法。将此工作流程应用于从两个独立队列中收集的血浆样本，结果发现噬菌体组通过病原体特异性的过度代表来反映感染。此外，作者表明噬菌体可以区分密切相关的细菌物种。总之，数据表明血浆中循环噬菌体序列为研究感染中的噬菌体生态学提供了一种非侵入性方法。

图片来源：Nature microbiology

循环噬菌体组

为了确定健康受试者或血培养阳性感染患者中是否存在循环噬菌体，作者分析了斯坦福大学急诊科的61例败血症患者以及10例无症状对照者的血浆cfDNA。脓毒症样本代表20种不同的细菌感染，使用下图a所示的工作流程对样本进行测序及分析，结果显示无症状对照组和脓毒症患者的血浆cfDNA主要由人类reads组成(图b)。尽管非人类reads所占比例相对较小，但却代表了丰富的微生物群落(图c)。在无症状个体中，最大的单一属是Cutibacterium，一种已知的皮肤定植菌。不到1%的reads对应于哺乳动物病毒，而在无症状和脓毒症患者样本中，分别有8.80%和9.62%的非人类reads映射到噬菌体，并且所有样本都含有噬菌体reads。

噬菌体reads反映了多种噬菌体家族(图d)，有尾噬菌体家族Myoviridae和Siphoviridae占主导地位。无症状对照组和脓毒症患者循环噬菌体中噬菌体家族代表性无统计学差异。Shannon多样性指数(Shannon Diversity Index, SDI)是一种衡量循环噬菌体物种丰富度甚至均匀度的常用生态量化指标，在两组之间没有显著差异(图e)，这些发现表明没有广泛的“脓毒症噬菌体”特征。

血浆样本工作流程及循环噬菌体组

图片来源：Nature microbiology

循环噬菌体组反映感染病原学

在已知宿主细菌的噬菌体中，大多数对应于假单胞菌、埃希氏菌、克雷伯氏菌、表皮菌和链球菌属。细菌宿主比例因脓毒症状态而无显著差异。许多噬菌体有未知的细菌宿主，在无症状和脓毒症患者组中分别占噬菌体的47.2%和37.4%。

另外研究还发现，因大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌和克雷伯氏菌感染引起的脓毒症患者在与致病病原体对应的噬菌体比例中具有相应的过度代表性(下图h-k)。研究团队还计算了噬菌体的生态多样性。将SDI应用于数据集中至少7个样本的每种感染病原学，发现大肠杆菌，链球菌，葡萄球菌和克雷伯氏菌脓毒症患者中病原体特异性噬菌体群体的SDI增加(下图l-o)。

综上所述，非人类cfDNA的含量，包括细菌、真核生物和病毒DNA以及噬菌体家族，多样性和注释的细菌宿主，在健康和败血症中大致相似。然而，血培养阳性的脓毒症患者的噬菌体更能代表其脓毒症的细菌病因。

循环噬菌体组反映感染病原学

图片来源：Nature microbiology

在另一项大型研究中，cfDNA噬菌体组反映了病原体

作者试图在一个更大的、临床更多样化的患者群体中验证此发现。SepSeq研究是一项对391个人进行的队列研究，使用细菌cfDNA来诊断脓毒症原因，患者具有广泛的感染病因。

SepSeq研究中有四种患者群体:(1)血培养阳性脓毒症患者，(2)血培养阴性脓毒症患者，其他地方有感染记录，(3)全身性炎症反应综合征(SIRS)，临床表现为脓毒症，但最终没有确定感染病因，(4)无症状对照。

作者再次发现循环噬菌体组在健康人和败血症中非常相似。虽然脓毒症患者和血培养阳性患者的整体噬菌体多样性较高，但鉴定出的噬菌体所代表的细菌宿主比例基本稳定。最常见的细菌宿主是肠杆菌、埃希氏菌、葡萄球菌和链球菌，即使在健康患者中也是如此。在血液培养阳性的大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌和克雷伯氏菌感染患者中，病原体相关噬菌体的比例(图e-h)和多样性(图i - l)均显著高于其他感染或SIRS的个体。

SepSeq研究再次证明了没有统一的“脓毒症噬菌体”。然而，在细菌感染的背景下，感染相关噬菌体的比例和多样性一直被过度代表。这表明血浆cfDNA测序为研究细菌感染生态学提供了一种替代感染部位的液体测序方法。

cfDNA噬菌体组在另一项大型研究中反映了病原体

图片来源：Nature microbiology

大肠杆菌噬菌体反映宿主菌株的特征

大肠杆菌噬菌体在无症状患者中是散发的，在SIRS患者或非大肠杆菌脓毒症中更常见，并且在大肠杆菌脓毒症患者中普遍存在。大肠杆菌脓毒症中，Siphoviridae、Podoviridae和Myoviridae噬菌体家族的大肠杆菌噬菌体显著富集，而Autographiviridae噬菌体在感染状态下仍保持稳定的低水平(图b-e)。

大肠杆菌噬菌体的多样性令人难以置信，在36名大肠杆菌败血症患者中发现了500多种独特的噬菌体。根据噬菌体在样本中的流行程度分为三组。在几乎所有的大肠杆菌败血症患者中都存在一组普遍存在的大肠杆菌噬菌体（第一组），而在其他组中则没有。第二组代表噬菌体存在于许多但不是所有的大肠杆菌败血症患者。第三组噬菌体仅存在于少数样品中——大多数噬菌体仅存在于一两个患者中(图f)。第一组大肠杆菌噬菌体具有明显的Siphoviridae噬菌体富集;Podoviridae噬菌体在第二组中占主导地位;第三组罕见的噬菌体亚群主要是Myoviridae噬菌体。

总之，这些数据表明，来自真实感染样本的噬菌体与产生毒素的大肠杆菌宿主致病变异有关，可能有助于区分真正的感染和定植。

大肠杆菌噬菌体反映宿主菌株的特征

图片来源：Nature microbiology

噬菌体在葡萄球菌感染中识别细菌种类

基于血浆的微生物分析的一个困难是，近邻的细菌物种基因组可能难以区分。

在葡萄球菌感染的情况下，细菌cfDNA可能在区分细菌属中的物种方面表现不佳。研究团队评估了金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌之间的噬菌体生态学是否存在差异。结果显示，不管哪个队列，细菌cfDNA无法区分金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。但感染金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的噬菌体种群是不同的，金黄色葡萄球菌噬菌体多样性仅在金黄色葡萄球菌感染中显著增加(图e)。这反映在AUC为0.96的ROC图中(图f)。

这些数据表明，噬菌体亚群，特别是金黄色葡萄球菌噬菌体，是比较近邻细菌感染的潜在目标。

噬菌体组鉴别葡萄球菌感染的细菌种类

图片来源：Nature microbiology

总结与讨论

噬菌体序列存在于血浆cfDNA中，这一信息可用于非侵入性研究细菌感染中的噬菌体生态学。作者揭示了感染与病原体特异性噬菌体的增多有关，从而可以识别细菌病原体，还发现噬菌体多样性的信息能够鉴定产生这些噬菌体的细菌，包括大肠杆菌的致病菌株。噬菌体序列同样可以用来区分密切相关的细菌种类，如金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。噬菌体cfDNA在研究细菌感染方面可能具有实用价值。需要进一步的研究来调查噬菌体如何进入血液，以及这如何随感染部位和细菌负荷而变化。在试图确定诊断上有用的噬菌体靶标之前，需要更大规模的研究来捕获感染背景下的噬菌体异质性。

总之，作者表明，使用cfDNA的NGS测序在无症状和感染个体中都可以检测到循环噬菌体，并且噬菌体cfDNA可以帮助在群体水平上研究感染中的细菌和噬菌体生态学。相信利用噬菌体进行非侵入性细菌感染生态学研究具有很大的前景，进一步探索细菌感染背景下的细菌噬菌体生态学和动力学将为今后利用噬菌体进行非侵入性诊断奠定基础。