IVD前沿丨4小时快速鉴定和定量病原菌的新方法

脓毒症是指由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。对于怀疑患有脓毒症的患者，适当的抗生素治疗结果良好，死亡率显著降低。然而，为了选择最佳的初始抗菌治疗，早期鉴定致病微生物至关重要。且还需要严格反映脓毒症严重程度的生物标志物。目前用于反映脓毒症严重程度的生物标志物包括降钙素原、催血素和c反应蛋白(CRP)水平;体温(BT);和白细胞(WBC)计数。然而，虽然这些生物标志物在一定程度上与脓毒症的严重程度相关，但它们并不总是准确反映特定时间点的严重程度。因此，目前还没有真正可靠的脓毒症生物标志物。

“血液样本中细菌的数量”可作为一种新的生物标志物来准确判断脓毒症的严重程度，不是宿主防御的结果，而是病原体本身的直接信息。在临床样品中定量检测特定类型的细菌(如结核分枝杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌等)已有报道。然而，临床样品中未知细菌的定量检测在技术上是相当困难的。事实上，目前还没有关于准确定量临床样本中未知致病菌的方法的报道。

近日，一组来自日本的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Novel rapid method for identifying and quantifying pathogenic bacteria within four hours of blood collection”的文章。文章中作者开发了一种真核生物来源的耐热DNA聚合酶，它没有细菌DNA污染，使临床样品中少量细菌的定量检测成为可能。作者还开发了一种基于熔解温度(Tm)的定量方法，可以根据Tm mapping法鉴定的病原体的16S rRNA操纵子拷贝数进行校正。这样在临床样品中可使用实时PCR对未知细菌进行鉴定和定量。与其他生物标志物相比，脓毒症血液样本样品中的细菌数量，更适合作为传染病的一种新的生物标志物。

图片来源：Scientific reports

主要内容

PCR检测病原体的挑战及解决方案

如果细菌种类未知，可以使用细菌通用引物针对细菌16S核糖体RNA (rRNA)基因的高度保守区域检测广泛的细菌。但在PCR过程中使用的试剂，特别是耐热DNA聚合酶，通常被微量的细菌DNA污染。只要致病菌的数量很少，细菌DNA污染就成为一个主要问题。为了解决这个问题，作者开发了一种真核生物制造的耐热DNA聚合酶，它不受细菌DNA污染，使临床样品中少量细菌的定量检测成为可能。

未知细菌定量检测的另一个问题是细菌基因组中16S rRNA操纵子拷贝数的差异。使用细菌通用引物的定量结果不能反映实际细菌浓度，除非根据病原体的16S rRNA操纵子拷贝数进行校准。作者提出一个基于熔解温度(Tm)的定量方法，定量结果可以根据Tm mapping法鉴定的病原体的16S rRNA操纵子拷贝数进行校正。

快速鉴定和定量的工作流程

未知致病菌快速鉴定和定量方法工作流程包括五个主要步骤（下图）。

1. 直接从临床样本(2ml全血样本等)中提取细菌DNA作为PCR的模板。还预先制备了三种已知浓度(细菌数/mL)的定量标准品(大肠杆菌DNA溶液)。

2. 使用7种细菌通用引物和真核生物来源的耐热DNA聚合酶进行巢式PCR，获得七个(或更少)PCR扩增子。

3. 通过分析扩增子获得7个Tm值。

4. 在两个维度上mapping七个Tm值。该图创建了一个独特的物种特定形状，称为Tm mapping形状。通过将Tm图谱形状与数据库中的形状进行比较，可以快速鉴定分离的细菌。

5. 利用已知浓度的三种不同定量标准(大肠杆菌DNA)的Ct值形成的标准曲线，计算细菌浓度。最后，根据Tm作图法快速鉴定的细菌的16S核糖体RNA操纵子拷贝数对细菌浓度进行校正。因此，可在采集样品后4小时内获得临床样品中病原菌的鉴定和定量结果。

全血采集后4小时内鉴定和定量脓毒症未知致病菌的新型快速方法的工作流程。图片来源：Scientific reports

定量方法的建立

1. 从全血样本中分离细菌的过程中尽可能减少细菌细胞的损失。将血液样品低速离心(100×g, 5分钟)，使用上清部分。这一步中，血浆中细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌)的分布几乎没有变化(下图A)。

2. 对血液样本中细菌进行精确定量实时PCR。巢式PCR引物设计如下图B所示。在这一步中，需要消除引物与细菌靶区碱基序列差异对Ct值的不利影响。为了解决这个问题，作者使用了混合1st PCR正向引物(全匹配:1个错配= 1:1)(图C)。此外，在第二次PCR中，使用region 3扩增子来定量细菌。结果显示，当使用混合的1st PCR正向引物和region 3引物时，无论细菌种类如何，细菌的准确定量实时PCR都是可行的。

3. 第三步，采用巢式PCR法。此外，为了消除引物二聚体形成对定量的不利影响，将荧光采集温度设置为82°C。结果表明，Ct值与大肠杆菌计数/PCR管的对数线性相关(R2值)> 0.99(图D)，定量限为大肠杆菌基因组DNA 1.0个/PCR管，线性动态范围(大肠杆菌基因组DNA 1.0 ~ 4.1 × 105个/PCR管)。

定量方法的建立。图片来源：Scientific reports

脓毒症血样中病原菌的鉴定与定量

此方法在任何健康对照组的血液样本中都没有检测到细菌。对脓毒症血液样本(以及健康对照样本)中的致病菌进行鉴定和定量，然后检测细菌数量、BT、WBC、CRP、presepsin和IL-6值在抗生素治疗前、治疗后24和72 h的时间依赖性变化(如下图)。

病例1(图A)：Tm mapping结果正确鉴定为大肠杆菌。抗生素治疗前，大肠杆菌数量为1320 /mL。在抗生素治疗24 h后，大肠杆菌数量下降到260个/mL，尽管除IL-6外其他当前生物标志物均有所增加。在抗生素治疗72小时后，血液中不再检测到细菌。

病例2(图B)：Tm mapping结果为多微生物感染，即无法确定病原菌，血培养结果为产氧克雷伯菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。抗生素治疗前，细菌数量为175,280/mL。在抗生素治疗24 h后，细菌数量下降到31,460/mL，尽管WBC、CRP和prepsin值有所增加。在抗生素治疗72 h后，细菌数量减少到2060个/mL。

病例3(图C)：Tm mapping结果正确鉴定为大肠杆菌。抗生素治疗前，数量为3600个/mL。在抗生素治疗后24 h，大肠杆菌数量下降到2100个/mL，尽管CRP值有所升高。在抗生素治疗72小时后，血液中不再检测到细菌，尽管BT和presepsin值有所增加。

病例4(图D)：Tm mapping结果正确鉴定为为S. dysgalactiae。抗生素治疗前，菌数量为2660个/mL。在抗生素治疗后24 h，尽管CRP值有所升高，但菌已降至300个/mL。在抗生素治疗72 h后，尽管BT有所增加，但菌已减少至20个/mL。

病例5(图E)：Tm mapping结果正确鉴定为产气肠杆菌。抗生素治疗前，菌数量为41,090个/mL。抗生素治疗24 h后，产气大肠杆菌的数量下降到19145个/mL，尽管WBC、CRP和prepsin值有所增加。在抗生素治疗72 h后，菌下降到70个/mL，尽管CRP和presesin值有所升高。

健康对照(图F)：Tm mapping法和血培养均未检出细菌，CRP和IL-6均低于检测灵敏度。BT、WBC、Presepsin均在正常范围内。每种生物标志物几乎没有日常变化。

脓毒症患者抗生素治疗前及治疗后24、72 h细菌数量、BT、WBC、CRP、Presepsin、IL-6的时间依赖性变化。图片来源：Scientific reports

脓毒症血液生物标志物

通过5例败血症患者，作者发现细菌数量是一种新的有用的生物标志物，比现有的生物标志物(BT、WBC、CRP、presepsin和IL-6)更敏感地反映治疗效果。目前的生物标志物反映的是宿主对微生物的免疫反应，因此不可避免地会造成时滞。尽管抗菌治疗有效，但目前的生物标志物在抗生素给药后24小时仍呈上升趋势。

本新方法所述细菌数是指血浆和buffy coat中细菌总数，即血液中漂浮的细菌和被白细胞吞噬的细菌总数。脓毒症血液中漂浮的细菌数量与被白细胞吞噬的细菌数量之比约为1:10，被白细胞的吞噬的细菌是一种病原体。尽管血浆中存在细菌，但buffy coat中没有细菌则表明是污染。

总结与讨论

在本研究中，作者开发了一种新的快速方法，用于在样品采集后4小时内鉴定和定量临床样品中的未知致病菌(日本专利号7023465，国际专利申请号PCT / JP2018/023597)。Tm mapping法作为该方法的主要技术，无需血培养即可快速识别数据库中登记的160多种物种。这种新方法可以用来确定临床样品中的细菌数量，作为传染病的一种新的生物标志物。

为了精确测量临床样品中的细菌数量，作者不仅开发了真核合成的耐热DNA聚合酶，而且无污染的PCR管，蒸馏水，引物，DNA提取试剂盒，和适当的实验环境是必不可少的。另一个主要问题是真空采血管的细菌DNA污染。市售10根采血管中有8根检测到细菌DNA，这将阻碍准确检测临床样本中少量细菌的尝试。为了解决这一问题，作者开发了一种细菌DNA无污染的真空采血管。

总之，新方法能够在全血采集后4小时内对临床样本中的细菌进行鉴定和定量。根据血液样本中细菌的数量，可准确地估计微生物感染的严重程度，还能够准确地监测治疗效果。因此，细菌的数量可能为决定停止抗生素治疗的最佳时机提供线索。这种快速鉴定和定量细菌的方法可能会改变医疗保健方法。