直接从血液检测病原体的技术和挑战

摘要 半个多世纪以来，血培养一直是临床微生物学实验室的主要手段，但我们在识别出现脓毒症体征和症状的患者中的病原体的能力方面仍然存在差距。分子技术在许多领域彻底改变了临床微生物学实验室，但尚未提供血培养的可行替代方案。最近人们对利用新方法来应对这一挑战的兴趣激增。在这篇小型综述中，我讨论了分子工具是否最终会为我们提供所需的答案以及将它们纳入诊断算法的实际挑战。

关键词： PCR, 血培养, NGS, 脓毒症

血培养已成为检测血流病原体的主要方法，从需要每日和终末传代培养的手动系统开始，到 20 世纪 60 年代末自动化血培养系统的发展。随着时间的推移，技术的不断改进和我们对病原体动态的了解已经越来越多。提高血培养产量。连续监测血培养系统的出现使培养时间从 7 天减少到 5 天。现在，血培养瓶通常可容纳比 20 世纪 80 年代 (5 mL) 更大的血液量 (10 mL)，这使我们能够更好地对脓毒症患者的低细菌负荷进行检测。培养基添加剂和先进检测算法的使用进一步提高了血培养产量并缩短了获得阳性结果的时间。与旧的自动化系统相比，封闭式孵化系统的使用不仅提供了更好的周转时间 (TAT)，而且还提供了更高的产量。

血培养呈阳性只能告诉我们细菌生长的存在。疑似脓毒症患者应根据就诊时的症状/结果使用广谱抗生素。可操作的信息来自生物体识别和耐药标记物检测/抗菌药物敏感性测试结果，指导治疗。革兰氏染色允许提供者潜在地缩小治疗范围并降低抗生素的用量。然而，众所周知，细菌会表现出不典型的染色，这与用户错误一起可能会提供不正确的信息，从而带来潜在的严重后果。进一步的信息需要进行生化和抗菌药物敏感性测试，使用自动化系统需要 24 至 72 小时。使用快速多重 PCR 检测板和基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 的直接从阳性血培养物中鉴定病原体，使提供者能够使用当地的抗菌谱做出明智的选择 治疗。基于多重 PCR 的耐药标记检测可以在 48 至 72 小时内获得完整的药敏测试结果之前更加可靠地选择抗生素。新型快速药敏试验方法可以在血培养结果呈阳性后 12 小时内提供完整的药敏试验结果和 MIC。同一阳性血培养瓶中存在多种病原体可能会使快速药敏试验方法的使用变得复杂。

所有这些都取决于最初的阳性血培养结果，需要至少 12 至 48 小时的培养才能获得阳性结果。脓毒症患者获得可操作培养结果的时间稳步缩短。这是通过缩短血培养呈阳性的时间或直接将快速识别方法与阳性血培养结合起来实现的。研究表明，脓毒症患者面临的重大风险与延迟结果和不适当的治疗有关，每延迟一小时使用适当的抗生素就会增加死亡率。一些研究表明，机会之窗可能会更长。在一项对 9,000 多名血流感染 (BSI) 患者进行的大型研究中，van Heurverswyn 等人证明死亡风险仅在血培养采集后 12 小时增加。作者推测，这可能是由于脓毒症发作和患者到达急诊室之间的时间间隔存在差异。不幸的是，医疗服务提供者通常没有时间等待血培养结果呈阳性。更糟糕的是，相当一部分脓毒症患者的血培养结果可能呈阴性，在这种情况下，缺乏可靠的诊断是及时和适当管理的重大障碍，并强调需要分子方法来检测脓毒症病原体。

脓毒症管理和更好诊断的需要

任何有关脓毒症诊断的讨论都需要了解目前脓毒症中血培养的使用情况。在美国，医疗保险和医疗补助服务中心 (CMS) 对于严重脓毒症和脓毒性休克早期管理套件 (SEP-1) 是我们脓毒症管理方法的关键驱动力。由重症监护医学协会 (SCCM) 和欧洲重症监护医学协会 (ESICM) 联合发布的2016年脓毒症生存指南建议，对于疑似脓毒症和脓毒性休克的患者，在开始抗菌治疗前 1 小时内收集血培养物。2016 年的指南并未得到美国传染病协会 (IDSA) 或传染病药剂师协会 (SIDP) 的认可。人们担心疑似脓毒症患者和感染性休克患者之间缺乏区分，随后发现很大一部分（＞40%）疑似脓毒症患者患有非感染性疾病。这将导致不必要的血培养、抗菌药物的使用以及其他干预措施，以努力满足 1 小时的最后期限。IDSA 建议额外时间对疑似脓毒症患者进行评估， SIDP 同意 IDSA 的观点，即需要区分疑似脓毒症患者和脓毒性休克患者。

2016 年《拯救脓毒症指南》将医疗服务提供者置于必须先行动后思考的境地，这可能会促进血培养和抗生素的滥用。负面后果包括由于污染而导致的血培养假阳性，这与住院时间延长、不必要的诊断程序、拔管以及过度使用抗生素有关，特别是万古霉素的经验性使用使高达 25% 的患者出现肾毒性。血培养污染事件给医院造成的损失可能为 8,000 美元到 25,000 美元不等。滥用抗生素的负面后果已得到充分描述，但常常被忽视。对院内抗生素给药模式的审查显示，影响提供者抗生素使用决策的主要驱动因素是担心不良结果和不确定性，而很少考虑抗生素耐药性或抗生素引起的患者伤害。倡导明智使用血液的诊断管理举措的实施表明，不撒大网、不考虑附带损害（译者注：引起附带损害小）的方法具有优势。推动实现脓毒症治疗目标可能会鼓励不必要的抗菌药物的使用。一些人认为，这种积极的做法并未对死亡率产生任何明显的影响，尽管其他人对此提出了争议。

《拯救脓毒症》指南于 2021 年更新，现在区分了脓毒症休克/脓毒症可能性高的患者与可能脓毒症但不伴有休克的患者。对于脓毒症休克/脓毒症可能性高的患者，建议在 1 小时内使用抗生素（和血培养）；对于可能脓毒症但无休克的患者，建议在 3 小时内使用抗生素（和血培养）。这种方法（现已得到 IDSA 认可）可以评估可能的替代诊断并更好地管理抗菌药物和血培养。即便如此，2021 年指南的作者评论说，超过三分之一的初次脓毒症诊断患者后来被发现患有非感染性疾病，并且缺乏脓毒症病原体检测的“金标准”测试仍然是一个持续的挑战。虽然这场争论主要集中在血培养上，但任何使用新技术解决这些问题的根本原因（即血培养敏感性不足）的尝试都必须应对同样的挑战。

我们如何解决血培养的局限性？

血培养对于致命疾病来说仍然是一个不完美的工具——30% 到 50% 的阳性血培养是被污染的血培养，并对之后的判断处理产生相关的负面影响。疑似脓毒症病例中很大一部分（40% 至 60%）出现血培养假阴性， 原因包括 28% 至 63% 的患者先前接受过抗生素治疗、存在挑剔/不可培养的微生物、采集的血液量不足或由于微生物负荷低而缺乏敏感性。在一项研究中，30% 的中心静脉导管相关血流感染 (CLABSI) 是由于血培养物污染造成的，这反过来又对医疗保健机构产生重大的质量和财务影响。

这给我们留下了一个诊断难题——需要新的方法来诊断脓毒症，但新的工具需要跨越最佳灵敏度和特异性之间的界限。血液培养物使用不当所面临的挑战将继续存在，甚至可能在基于核酸扩增的检测（NAAT）中加剧，尤其是如果不加区分地使用。在实验室的其他领域，NAAT极大地改变了我们的诊断和管理方法。病毒培养已被分子诊断完全取代，灵敏度和速度显著提高；另一方面，从基于培养基到基于NAAT的粪便胃肠道病原体多重检测的转变导致产量增加了10倍，尽管对患者结果的影响仍然是一个有争议的话题。脓毒症假阳性率增加的影响可能要显著得多。

脓毒症病原体的分子检测有两种潜在的方法。

1. 基于患者的快速仪器，从全血中提取基因组材料，并利用针对一组特定目标生物体的基于 NAAT 的测试，在相对较短的时间范围内（1 至 3 小时）提供结果。

2. 基于下一代测序 (NGS) 的系统能够更客观来检测血流病原体，但由于技术的性质，需要专门的设备/专业知识，并且需要 12 至 48 小时才能提供结果。

使用宿主免疫标记物来识别需要积极治疗的脓毒症患者也取得了并行进展。虽然这项技术有可能帮助针对最需要的患者进行血培养和其他干预措施，但它无法识别所涉及的病原体。关于这些方法的进一步讨论可以在其他地方找到。

基于 NAAT/NGS 的脓毒症病原体检测面临的挑战

血液往往是一种难以进行分子分析的样本类型，许多血液成分，包括免疫球蛋白、血红蛋白、乳铁蛋白等，可以通过直接干扰聚合酶活性来干扰基于NAAT的扩增，降低反应效率和荧光猝灭。血液中大量人类基因组材料的存在也带来了挑战，需要在DNA提取前分离白细胞或在提取后降解人类基因组材料。虽然采样更大体积的血液可以提高检测灵敏度，但也增加了分离病原体基因组材料的挑战。替代方法试图从血浆中分离微生物无细胞DNA（cfDNA）以通过NGS进行鉴定。微生物cfDNA仅占循环中cfDNA的一小部分（0.08%至4.85%），尽管在包括脓毒症在内的许多情况下可能会注意到水平升高。

为了改善脓毒症诊断，基于 NAAT 的检测需要改善血培养的缺陷，例如通过提高灵敏度和更快获得结果，同时保持特异性。血培养试图通过增加采集的血液总量来部分克服其局限性。通过抽取两到三组血培养物，我们可以抽取 40 到 60 mL 的血液样本。基于 NAAT 的测试无法采样如此大的体积，必须依靠提高的分析灵敏度来补偿。血培养依赖于活生物体，而基于 NAAT 的测试可以检测非活细胞甚至细菌基因组片段。Bacconi 等人估计，血液中病原体基因组物质的浓度比活细菌的浓度高 2 至 3 个数量级。这些发现与使用 PCR 检测来定量血液中特定病原体的研究相关。Peters 等人能够分别定量 27/31 (87%) 和 17/18 (94%) 血培养阳性患者中金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的数量。他们计算出金黄色葡萄球菌的中位细菌 DNA 载量 (BDL) 为 10.6 × 103 CFU 当量/mL，粪肠球菌为 2.7 ×103 CFU 当量/mL：即显着高于活生物体的预期水平。其他研究也表明，与培养物相比，血液中细菌基因组物质的含量同样更高。

生物体负荷如何影响检测性能？ 多项研究表明，PCR 测定的定量细菌载量与患者结果和疾病严重程度相关。Kirkbright 及其同事发现，对于金黄色葡萄球菌或大肠杆菌血培养呈阳性的患者，高 16S rRNA 基因负载与感染性休克的发生有关。对金黄色葡萄球菌菌血症患者的 mecA 进行定量分析还发现，较高水平的 mecA 是死亡率的预测因子。在一项针对 353 名患者的单中心研究中，Rello 等人表明，社区获得性肺炎患者血液中肺炎链球菌细菌载量升高（1,000 拷贝/毫升）与感染性休克的可能性独立相关。RADICAL 研究利用 PCR/电喷雾电离质谱 (ESIMS) 直接基于 NAAT 检测血液中的病原体。作者发现，虽然血培养呈阳性和不呈阳性的患者的 28 天死亡率没有差异，但 PCR/ESI-MS 结果呈阳性的患者的死亡率显着较高（42% 与 26%；P = 0.001）。这些发现似乎极大地强调了基于 NAAT 的检测的潜力，不仅可以检测血液中的病原体，还可以作为识别可能需要积极干预的患者的一种手段。

需要指出的是，这些发现主要是在血培养呈阳性的患者中进行的单一病原体检测中得出的。对无症状个体血液中微生物 cfDNA 的无偏分析在 22.8% (38/167) 中产生阳性结果，大多数病例仅涉及单一物种。虽然这些细菌通常包括肺炎克雷伯菌或流感嗜血杆菌等潜在病原体，但它们的水平通常低于培养证实的菌血症患者。另一项研究中，23/89 (26%) 的健康个体中检测到细菌 16S rRNA 基因。这些无症状个体的 cfDNA 可能源自跨上皮细胞的易位。外伤或感染引起的组织损伤也可能促进这一过程。在与脓毒症无关的情况下，微生物 cfDNA 水平升高。Grumaz 等人指出，与健康捐赠者相比，脓毒症患者血浆 cfDNA 水平显着升高（平均分类读数分别为 9.8% 和 3.5%）。这表明在解释微生物 cfDNA 水平检测的重要性时需要定量截止值。确定正常背景信号的构成不仅受到个体之间差异的挑战，而且还受到患者临床状态差异的挑战。上皮受损/外伤的重病患者可能表现出相对较高水平的 cfDNA。Blauwkamp 等人注意到血浆中铜绿假单胞菌 cfDNA 的水平明显高于其他生物体，这表明需要针对生物体特异性的截止值来确定显着性。Simner 等人评论了基于 NGS 的测试中人类污染物组的挑战，指出 对于血液和脑脊液等微生物与宿主 DNA 比例相对较低的样本来说，问题尤其严重，葡萄球菌和假单胞菌等已知病原体也经常作为常见污染物大量出现。

目前有哪些基于 NAAT/NGS 的检测系统可用？

基于 NAAT 的直接血液检测。尽管为解锁临床微生物学的圣杯（即用于检测脓毒症病原体的可靠且具有成本效益的分子检测）付出了巨大的努力，但测试选择仍然有限。这并不是因为缺乏努力，而是反映了开发这种检测方法所面临的挑战。对 Roche Septifast（瑞士巴塞尔罗氏诊断）和 Iridica（美国伊利诺伊州雅培诊断）等平台进行了大量投资，但这些平台最终退出市场。Septifast 和 Iridica 检测的故事对于投入大量资源和时间将这些检测推向欧洲市场的检测开发人员来说是一个警示。尽管获得 CE 标志已超过 2 年，Iridica 平台仅被三家医院采用，并最终从市场上撤出。使用这些检测方法的实际挑战以及监管问题（而不是性能问题）是这一决定的主要驱动因素。美国境外还有许多其他平台，包括 VYOO 快速病原体识别系统（Analytik Jena Gmbh，德国耶拿）、MagicPlex Sepsis（Seegene，首尔，韩国）和 Sepsitest（Molzym Molecular Diagnostics，德国不来梅）。这些平台表现出不同的性能，大多数平台相当耗时/劳动密集型，并且阳性/阴性预测值不足，无法被视为血培养的可行替代方案。目前有多个平台处于不同的开发阶段， 其中一些利用其系统提供全血样本提取/浓缩，同时他们继续开发基于 NAAT 的血液病原体检测。这里不讨论有关目标和检测性能的详细信息，因为对于大多数这些平台来说，这些信息要么不可用，要么在开发过程中可能会发生变化。

目前只有一家制造商提供 FDA 批准的基于 NAAT 的检测方法，用于直接检测血流病原体。T2细菌 (T2B) 和 T2念珠菌 (T2C) (T2 Biosystems, Lexington, MA, USA) 检测分别用于检测全血中的细菌和真菌病原体。每次检测在自动化平台上使用 4 mL 全血，可在 3 至 5 小时内提供结果。T2B 检测可检测屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。T2C 检测可检测 5 种念珠菌——白色念珠菌/热带念珠菌、光滑念珠菌/克柔念珠菌和近平滑念珠菌。该检测依赖于基于 NAAT 的测试与 T2MR 磁共振技术（即带有目标特异性探针的超顺磁性颗粒）的结合，并声称检测限 (LOD) 为 2 至 11 CFU/mL。T2B 检测涵盖了代表 50% 以上的血流感染 (BSI) 中存在的病原体的目标。

基于 NAAT 的检测在脓毒症中的效果如何？在 Nguyen 等人的一项分析中，T2B 测定对已证实的 BSI 显示出 90% 的敏感性和 90% 的特异性。共有 146/1,427 (10%) 名患者 T2B 呈阳性，但血培养呈阴性。在这些环境中评估基于 NAAT 的检测面临的挑战是确定 NAAT 阳性/血培养阴性结果是否代表培养漏检的真阳性或 NAAT 假阳性。通过评估 T2B 阳性结果后 21 天内的所有培养结果，Nguyen 等人确定至少 62/146 (42%) 的阳性 T2B 结果代表可能的 BSI，但 58/146 (40%) 可能是假阳性。T2B 的阳性率为 13% (181/1,427)，而血培养的阳性率为 3% (39/1,427)。4/39 (10%) 血培养阳性患者中 T2B 呈假阴性。T2B 生物体检测/鉴定的平均时间为 3.6 小时，血培养的平均时间为 38.5 小时。在 Di Angelis 等人对 T2B 性能的另一项分析中，与血培养相比，该测定法的敏感性和特异性分别为 83% 和 97.6%。超过一半 (11/20) 的 BSI 是由 T2B 面板上没有的细菌种类引起的。在两个平台上均检测到 10 个分离株，但仅在 T2B 上检测到 20 个分离株，T2B 遗漏了 2/12。根据图表审查，仅通过 T2B 检测到的 20 种分离株中，7/20 (35%) 被认为是真阳性结果。Kalligeros 等人进一步检查了 T2B 阳性/血培养阴性结果不一致的患者。总共 11/21 (52.5%) 代表可能的 BSI，而 6/21 (28%) 可能是污染物。

在美国以外，有大量文献评估 Septifast 平台的性能，该平台可识别 25 种常见败血症病原体。Chang 等人评估了 34 项 Septifast 研究，发现该检测具有较高的特异性，但敏感性不足。对该技术的另一项评估也发现了类似的结果，特异性为 85.8%（95% 置信区间 [CI]，83.3% 至 88.1%），敏感性为 50%（95% CI，39.1% 至 60.8%）。另一项技术审查评估了 Septifast 测定和 Iridica 系统（利用 PCR/电喷雾电离质谱 [ESI-MS]）。作者在直接比较 Septifast 与血培养物的研究中发现，估计特异性为 0.86（95%，可信区间 [CrI]，0.78 至 0.92），敏感性为 0.48（95% CrI，0.21 至 0.74）。四项比较 Iridica 与血培养的研究确定估计特异性为 0.84（95% CrI，0.71 至 0.92），敏感性为 0.81（95% CrI，0.69 至 0.90）。这些研究都得出了相同的结论：这些平台上的积极结果为提供商提供了价值，但消极结果却没有。

下一代基于测序的检验。 新一代测序（NGS）有可能改变诊断微生物学的格局。在我们充分利用这项技术的潜力之前，仍然存在重大障碍。病原体检测的公正方法避免了仅基于 NAAT 的检测所面临的许多问题。这也可能被证明是一把双刃剑——如前所述，全血/血浆中微生物 cfDNA 的存在给 NGS 带来了优势，但也 挑战过程的特殊性。这确实允许使用 NGS 来检测局部感染，并且不限制其在脓毒症中的作用。目前基于 NGS 的测试需要临床微生物实验室通常不具备的专业知识和仪器。与 NAAT 相比，该检验过程相对耗时，并且不能在患者附近使用。

基于 NGS 的检测的性能。 Rossoff 及其同事评估了 NGS 在免疫功能低下的儿科患者中的表现，这些患者的常规检测无法识别病原体。这是一个特别具有挑战性的人群，因为可用于培养的血液量很少。主要担心的是真菌感染（55%），其次是脓毒症（22%）。NGS 结果通常在样本采集后 48 小时内即可获得。70/100 份测试样本中 NGS 呈阳性，其中 33/70 检测到两种或多种病原体。大多数样本 (52/70) 至少鉴定出一种细菌，56/70 被确定为临床相关病原体。在 6 个病例中，NGS 未检测到随后通过常规检测鉴定的病原体。应该指出的是，选择这里评估的大多数案例是因为传统检测未能提供答案。

Blauwkamp 等人检查了基于 NGS 的方法的性能，该方法使用 350 名脓毒症患者血浆中的微生物 cfDNA 检测 1,250 种人类病原体。NGS 鉴定出 84.9% (112/132) 的通过常规方法检测到的潜在病原体，总体上鉴定出潜在病原体的比例为 169/348，而常规诊断方法为 132/348。根据图表审查对结果进行判定，NGS 平台的最终灵敏度为 93.7%。在两周内接受过抗菌治疗的患者中，NGS 识别出潜在病原体的比例为 46/96 (47.9%)，而仅进行血培养时为 19/96 (19.6%)。如前所述，对无症状个体的血浆进行检测，在 22.8% (38/167) 的样本中检测到微生物 cfDNA，脓毒症患者的特异性确定为 62.7%，平均获得结果的时间为 53 小时，其中包括运输所需的时间。

在其他研究中，NGS 通过检测许多本来可能被遗漏的细菌和病毒病原体，表现优于血培养。在 Long 等人的一项研究中，阳性患者的数量从使用常规血培养的 12.82% (12/78) 增加到使用 NGS 的 30.77% (24/78)。NGS 还能够检测 mecA 和 vanA/vanB 等抗性基因，尽管这种能力可能因平台而异，因为它需要高读取覆盖率。Jing 及其同事利用 NGS 检测了 209 个样本中的 53 种病原体。总体阳性率为 110/209 (52.6%)， 86/209 个样本的常规检测呈阳性，而常规检测呈阴性的 30/123 个样本中 NGS 呈阳性。使用复合参考标准时，NGS 的总体敏感性和特异性分别为 86.1% 和 80.2%。与血培养相比，NGS 对细菌的敏感性和特异性分别为 80.8% 和 79.6%。在 12 个样本中，NGS 未能检测到通过常规检测（培养和 PCR）发现的病原体，包括细菌和病毒靶标。除了脓毒症之外，NGS 可能对识别培养阴性心内膜炎患者的病原体产生影响。Flurin等人能够在5/6的血培养阴性心内膜炎患者中鉴定出潜在的病原体。

Blauwkamp 等人还评论了解释 NGS 结果和建立诊断灵敏度的挑战，特别是考虑到每个样本中检测到多种微生物以及不同患者群体的微生物组的多样性。微生物 cfDNA 以每微升血浆中的分子数 (MPM) 进行测量，在真正感染的情况下，其浓度范围为 20 至 450,000 MPM。作为参考，健康捐赠者的微生物 cfDNA 通常为 300MPM，这再次说明了解释 NGS 结果的挑战，因为这些值会根据平台和患者群体的不同而有所不同。

这些研究的共同点是，NGS 在识别传统检测可能漏掉的病原体方面提供了令人难以置信的潜力。然而，挑战仍然是难以解释培养阴性/NGS 阳性结果、假阴性以及多个目标的检测。

未来规划

此小型评论可能不代表当前正在开发的平台的完整列表。许多此类平台的可用信息通常很少，并且可能会发生变化。

Qvella FAST-ID BSI检测平台。 Qvella FAST-ID BSI检测平台（Qvella Corporation，安大略省，加拿大）旨在在 1 小时内从单个全血样本中检测覆盖 90% 引起 BSI 的病原体的目标。内置提取选择性地裂解血细胞、去除碎片并分离/浓缩细菌。随后进行裂解和基于 PCR 的 rRNA 靶标检测，涵盖广泛的革兰氏阳性、革兰氏阴性和真菌靶标。

LiDia Seq BSI/AMR 检测。 LiDia Seq BSI/AMR 检测平台（DNAe，伦敦，英国）使用基于半导体的测序来检测全血中的病原体和耐药标记，并在 3 至 4 小时内获得结果。

Biospectrix 平台。Biospectrix 平台（3iDx，德国马里兰州日耳曼敦）使用压力驱动的盒内选择性裂解技术从全血中分离细菌，同时在 30 分钟内分解血细胞。然后可以通过各种分子方法对分离的细菌进行分析。

SepsiSTAT 系统。 自动化 SepsiSTAT 系统（Momentum Biosciences，卡迪夫，英国）使用 12 mL 全血从基于 PCR 的检测和活细菌分离中提取细菌生物体，用于其他应用。

此外，Dayzero Diagnostics、Karius 和 PathoQuest 等参考实验室提供的 NGS 周转时间相对较快。这些通常包含隔夜运输和基于移动应用程序的报告，以便于使用。

脓毒症诊断新方法的优缺点

虽然 NAAT 和 NGS 都有望提高血培养的灵敏度，但每种方法都带来独特的优势和挑战，这些优势和挑战将影响到如何将它们纳入诊断算法。

使用方便： 基于 NAAT 的检测提供了快速、近距离检测的潜力，可以快速检测脓毒症病原体，从而满足脓毒症生存指南中规定的要求。NGS 仍然具有劳动密集型和昂贵的特点，并且需要大量的专业知识，以及无法及时获得结果；同时医院需要专门的分子实验室和人员，或者必须利用 NGS 公司进行检测。全自动 NAAT 平台有可能用于社区医院的应用环境。

灵敏度：基于 NAAT 的检测和 NGS 检测都比血培养具有更高的灵敏度。检测细菌 cfDNA 的能力可能具有显着的优点和缺点。基于NAAT的分离完整细菌的测定方法可能会牺牲一些增加灵敏度的潜力，转而增加特异性。

特异性：利用cfDNA的基于NGS的方法将面临开发可能具有平台/实验室特异性的定量临界值的挑战。独立开发这样的临界值可能会给单个临床实验室带来负担。基于NAAT的检测可能只提供定性结果，机构必须制定如何解释培养阴性/NAT阳性结果的指导方针。实际测定特异性的评估和培养阴性和NAAT/NGS阳性结果的意义的解释仍然是采用这些技术的最重大挑战。

样品类型：基于NAAT的检测可能必须依靠全血才能最大限度地提高细菌产量，而NGS主要是通过基于血浆的检测开发的。

测试成本：基于 NGS 的血浆检测主要在参考实验室进行，每个样本的成本通常为 2,000 美元。基于 NAAT 的测试虽然相对便宜，但如果大量使用，每年的支出很容易达到数十万美元。在这两种情况下，随着技术的不断发展，成本可能会大幅下降。评估基于 NAAT 的测试的成本效益的研究本质上是有限的，并且需要在该领域开展进一步的工作来证明使用该技术的合理性。

实际挑战： 基于 NGS 的测试需要昂贵的仪器、训练有素的人员和生物信息学专业知识。与基于 NAAT 的测试相比，NGS 通常还涉及更长的测试时间。至少需要过夜测试，但结果可能需要 12 至 48 小时。美国的许多实验室利用NGS公司进行基于 NGS 的测试，但这可能会延长获得结果的时间。NAAT 测试可能更容易实施，但仍然需要实验室资源和人员。最大的挑战是建立一个基于管理的系统，以确保结果得到实时利用。

基于 NAAT/NGS 的测试将如何影响临床微生物实验室

利用基于NAAT的测试涉及对实验室资源和人员的大量投资。BSI基于NAAT的常规检测成本可能很高，鉴于临床实验室面临的资源危机，需要仔细考虑。与许多新技术一样，基于NAAT的检测并没有取代现有的诊断检测（在这种情况下是血液培养），而是增加了另一层可能需要全天候支持才能有效的检测。除非全天候为提供者提供临床决策支持，否则在临床微生物学实验室实施新技术将不会成功。这将涉及开发和利用抗菌管理和基于电子病历的资源。

对于合并并为多个机构服务的实验室来说，这引发了一个问题，即是否需要将基于NAAT的快速检测平台放置在靠近医疗点地方，如急诊科或当地重症监护室（ICU）。在没有CLIA（临床实验室改进修正案）-放弃检测的情况下，这些测试将需要由实验室人员全天候操作。如果使用联合实验室，那么所涉及的运输时间可能会限制基于NAAT的快速测试所带来的一些好处。虽然指南建议及时处理血液培养物，但对于什么是“及时”，没有达成共识或监管指导。这是有问题的，因为随着血液培养物和相关流程的改进减少了检测时间，运输时间现在成为检测时间的重要组成部分。

关于基于NAAT的快速平台在现实环境中对脓毒症的影响，现有数据有限。这是一个令人担忧的领域，因为在缺乏显示对死亡率、住院时间或其他资源利用率的影响的数据的情况下，越来越难以证明这些新方法的成本合理性。另一个挑战是缺乏对基于NAAT的快速检测的目标人群的明确指导。还有一大堆问题有待回答：

.于 NAAT 的检测方法最好是广泛撒网，还是更好地针对特定人群？

.们在三级护理机构/ICU 中是否得到更好的利用？它们在急诊科 (ED)/社区医院中是否发挥作用？

.于最初 NAAT 阴性但持续出现脓毒症体征和症状的患者，重复 NAAT 检测有何作用？重复检测 NAAT 阳性患者以确定治疗反应有何作用？

.否需要从两个不同的位置多次 NAAT 测试来区分感染和污染（类似于血培养）？

基于 NAAT 的检测灵敏度和速度的提高是否能够更好地管理脓毒症患者并获得更好的结果？

血液培养显然不足以检测败血症的病原体——即使阳性研究表明，血液培养并不总是能转化为临床结果的显著差异，尽管它们确实提供了进行抗菌药物敏感性测试的机会。现在的问题是基于NAAT的测试是否能提供一些不同的东西。Quirino等人表明，在6/17例T2B阳性患者中，一旦有结果，经验性抗生素覆盖率就会发生变化。对于其余11名患者，经验覆盖率被认为是足够的，使用T2B时对21天死亡率没有显著影响。其他研究评估了在没有实际干预的情况下使用T2B的潜在影响，并推测在16/137名接受测试的ED患者中，T2B会缩短进行适当治疗或启用集中治疗的时间。Drevinek及其同事在53名患者的55个样本中使用了T2B。共有36.4%（8/22）的BSI病例仅通过T2B检测到，9/15 T2B结果呈阳性的患者能够接受早期/改良的靶向治疗。T2B还将物种鉴定时间缩短了55小时。对评估T2B/T2C的研究进行的荟萃分析表明，死亡率没有差异，但ICU/住院时间有所缩短。使用Septifast等较老技术的研究也有类似的发现，但没有评估超过适当治疗时间对结果的影响。在一项主要使用Septifast的一系列研究的荟萃分析中，D’Onofrio及其同事评论了临床结果报告的缺乏。只有2/25项研究表明住院/重症监护室的住院时间缩短，4/25项研究显示费用降低。

评估 T2B 性能的研究提出了关于使用基于 NAAT 的 BSI 快速检测的重大问题。结果是否产生可操作的信息？由于目标仅覆盖 50% 的潜在 BSI 病原体，即使检测对列出的目标有足够的阴性预测值，提供商也可能不会降低经验抗生素覆盖率。此外，即使 T2B 结果呈阳性，在缺乏有关耐药标记物存在的信息的情况下，在获得完整的培养和药敏结果之前修改治疗也可能具有挑战性。例如，患有金黄色葡萄球菌 BSI 的患者将接受万古霉素经验治疗。在这种情况下，如果没有 mecA 结果，T2B 结果呈阳性可能不会立即改变患者的治疗。解释 T2B 阳性/血培养阴性结果的意义仍然具有挑战性，T2B 检测阳性率的增加可能会给医疗保健机构带来许多挑战。未来具有更广泛目标的小组可能能够解决其中一些问题。

在评估NGS的影响时，Rossoff等人指出，在他们的100例病例队列中，如果NGS结果可用，34种侵入性手术可能会避免。一项关于血浆NGS常规使用的多中心分析评估了该测定在治疗变化、确定诊断或避免侵入性诊断程序方面的影响。总的来说，50/82个样本的NGS结果呈阳性，6/82个病例（7.3%）有阳性影响，3/82个病例有阴性影响（3.7%），71/82个病例（86.6%）没有影响（81），但是在解释积极的NGS结果方面存在重大挑战。作者得出结论，需要进一步的工作来确定哪些患者将从NGS中受益，特别是考虑到检测的巨大成本。

脓毒症诊断灵敏度增加的潜在影响可以在研究中评估，在这些研究中，位点已经过渡到改善血液培养性能的系统，无论是基于培养还是基于NAAT。Chavez等人评估了他们的血液培养系统从VersaTrek（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）过渡到Virtuo系统（bioMérieux，Durham，NC，USA）的影响。其他人之前已经证明，与前体BactT Alert（bioMérieux，Durham，NC，USA）相比，Virtuo系统具有更好的检测限（LOD）和检测时间（TTD）。然而，性能差异的实际程度只有在现实世界的实施过程中才会显现出来。血液培养阳性率从8.1%增加到11.7%（P，0.001），这包括金黄色葡萄球菌和其他血液病原体的产量显著增加。凝固酶阴性葡萄球菌的产量和血液培养物污染率同时增加（1.5%对1.9%；P。0.001），其他进行同样转变研究的人也观察到了类似的发现——血液培养物产量的显著增加伴随着血液培养物污染率的增加（Linoj Samuel和Robert Tibbetts，Henry Ford Health，个人通讯）。同一组还发现，金黄色葡萄球菌菌血症的中位持续时间在转换后1至3天显著增加。金黄色葡萄球菌菌血症持续时间较长的患者也更有可能接受氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描/计算机断层扫描 (FDG-PET/CT) 扫描，这些扫描在实施后期间获得的频率更高（实施前 1%，实施后 5%；p=0.04）。联合抗菌治疗在实施后使用得更频繁（实施前6%对实施后16%；P=0.003）。可以合理地推测，血液培养对金黄色葡萄球菌的敏感性增加转化为更好的患者结果，但尽管血液培养产量增加，但与实施前和实施后相比，90天全因死亡率、90天全因再次入院或住院时间没有变化。

当投资于提高灵敏度和缩短结果时间的技术时，不能假设这会自动转化为患者治疗结果的改善。评估从阳性血培养物中快速多重检测病原体和耐药标记物的影响的研究表明，可以缩短识别和有效/适当治疗的时间。这是以大量资本劳动力投资和每年数十万美元的试剂成本为代价的。在许多此类研究中，这些改善并不总是转化为患者预后的改善，例如死亡率、住院时间、30 天再入院等。虽然减少抗菌药物的使用是一个值得称赞的目标，但这一指标是否足以 证明 NAAT/NGS 所需投资的合理性。相反，使用 NAAT/NGS 预计的阳性率增加实际上可能会推动抗菌药物的使用增加。血液中 NAAT 阳性结果的增加也将导致更多侵入性和非侵入性诊断程序的使用，例如 CT 扫描和经食管超声心动图 (TEE)。我们知道，血培养的过度使用也是一个持续的挑战，这一挑战可能会延续到基于 NAAT 的检测中。需要仔细考虑制定有效的战略来利用新技术，特别是在资源日益减少的情况下。

Shehadeh 和同事确定，为了使基于 NAAT 的检测具有成本效益，需要将住院时间减少 2 至 4 天。许多评估基于 NAAT 的测试影响的研究都是回顾性/推测性分析，并且没有足够的结构来发现具有统计学意义和临床相关的结果。数据的缺乏阻碍了我们前进的能力，需要协调一致的努力来证明 NAAT/NGS 可以对反映改善结果和降低医疗成本的指标产生积极影响，例如死亡率、住院时间和 30 天再入院率。

监管问题和质量指标

将基于 NAAT/NGS 的新型测试纳入诊断标准的努力也可能受到当前监管环境和质量监控系统的挑战。由于实施基于 NAAT/NGS 的检测表面上会增发现血流病原体的敏感性，因此可能会增加该机构报告的中心静脉导管相关血流感染 (CLABSI) 的数量。CDC指南和Karius, Inc在这方面特别提到了T2B/T2C。美国疾病控制与预防中心确实允许，非基于培养物的方法（如T2B/T2C和Karius）产生的结果可以不计入CLBSI率，只要在非基于培养品的方法之前至少2天或之后至少1天抽取相应的血液培养物。展望未来，住院第 4 天发生的院内菌血症和真菌血症也可能作为新的可报告指标添加到国家医疗安全网络 (NHSN)，类似于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌血症。CMS 指标需要明确，以确保医院不会阻碍采用这些新技术。

为了鼓励采用新技术来检测脓毒症病原体，CMS 批准 T2B 作为第一个符合新技术附加付款 (NTAP) 条件的脓毒症体外诊断测试。NTAP 适用于标准医疗技术不足且新方法可提供实质性益处但成本高昂或报销不足的情况。CMS 表示，“T2 细菌测试组代表了对现有技术的重大临床改进，因为它减少了接受不适当治疗的患者比例，从而降低了后续诊断或治疗干预的比率以及脓毒症引起的住院时间和死亡率 引起细菌感染”。CMS 确定医院将获得 T2B 使用的额外 97.50 美元报销。目前尚不清楚这项福利是否会扩展到任何获得 FDA 批准的基于 NAAT 的脓毒症平台。NTAP产品的指定有效期仅为 3 年。

前进之路

几十年来，我们检测血流病原体的能力一直受到血培养检测活生物体的局限性的限制。NAAT/NGS 的出现有可能显着提高我们的诊断能力，但是采用这些技术仍然存在重大障碍。这两种方法似乎都不太可能在不久的将来取代血培养。除非有可靠的数据显示这些系统的好处和对患者结果的影响，否则那些因劳动力短缺和报销下降而苦苦挣扎的实验室可能会缓慢地采用这些系统。

这些是确定价值主张时需要解决的一些关键问题

NAAT 检测是否足够快速和灵敏，以便能够在脓毒症生存指南规定的 3 小时窗口内进行有针对性的干预？

NAAT/NGS 检测是否具有足够的阴性预测值以允许抗生素降级/停止，或者益处是否仅限于阳性结果的患者？

基于 NAAT/NGS 的检测预期阳性率的提高会产生什么影响？是否会导致额外诊断资源的消耗和抗菌药物的使用增加？此外，这些干预措施是否会转化为患者治疗效果的有意义的改善并降低护理成本？

Sweeney 等人提出了以下模型来采用新型脓毒症检测方法。

1. 使用宿主炎症标记物在护理点筛查患者，以确定需要积极干预的患者。

2.利用快速样本回答高危患者的NAAT平台，以确定病原体和耐药标记物以指导治疗。

3. 使用NGS进一步调查经验性治疗难治的持续性疾病患者，其中常规或基于NAAT的方法无法进行病原体检测。

结论

在检测引起BSI的病原体方面，我们正处于一场革命的风口浪尖。采用基于NAAT/NGS的检测的务实方法对于确保对检测方法的性能特征以及对患者和医疗保健机构的下游影响有深入的了解至关重要。