Cell Reports Medicine重磅综述：早期癌症检测和监测的挑战和机遇

癌症是当今世界上威胁人类健康的主要疾病，给社会造成了沉重的负担。虽然医学的进步使得越来越多的患者获得有效治疗，但是其生活质量和长期生存率仍然是一个重要的关注点。早期诊断对于提高癌症患者的生存率和降低护理成本至关重要。液体活检是癌症诊断策略的一个新兴前沿技术，可以对癌症进行微创分子表征，助力诊断、患者分层治疗和纵向监测，其策略包括检测和监测循环肿瘤细胞（CTC）、游离DNA（cfDNA）和细胞外囊泡（EV）。

文章发表在Cell Reports Medicine

美国麻省总医院、Exosome Diagnostics公司、Brigham妇女医院等单位的联合研究团队在Cell Reports Medicine发表了题为“The Liquid Biopsy Consortium: Challenges and opportunities for early cancer detection and monitoring”的综述文章，探讨了现有液体活检方法在癌症诊断和监测中的应用，特别讨论了与液体活检和生物标志物开发相关的技术和临床挑战。美国国家癌症研究所（NCI）成立了液体活检联合会正在解决这些挑战。该联盟开发了新的方法/检测方法，验证了现有方法/技术对于肿瘤衍生循环标志物的捕获和表征，为推进生物标志物检测提出了建议。

小编对该综述文章进行了翻译整理。

背景

虽然成像（乳腺）和一些基于血液的筛查（结直肠癌、前列腺癌）可应用于某些癌症，但这些方法并不能深入了解癌症的遗传特征。目前，癌症的临床诊断仍主要依靠传统的组织活检，以确认突变特征并指导治疗。微创早期检测可以提供分子诊断，以便及时对患者进行分层，以进行适当的治疗。     

在过去二十年中，液体活检领域发展迅猛，涉及对生物体液（血液、脑脊液（CSF）、尿液、唾液、羊水、腹水）样本的研究，检测分析癌症衍生的CTC、循环核酸（cfDNA、cfRNA、miRNA）、EV、肿瘤诱导的血小板、蛋白质和代谢产物。但大多数研究报道了来自单中心人群研究的结果，缺乏可重复性和稳健的验证和确认研究。

因此，大规模、多机构的合作对于开发具有临床实用性的液体活检方法至关重要。NCI癌症预防部发起并赞助了一项学术/商业合作计划，旨在推进和验证专门针对癌症早期检测的液体活检技术。由此诞生的液体活检联盟（LBC）开发、测试并交叉验证了捕获和表征肿瘤衍生循环标志物的新方法和分析方法，用于癌症的微创早期诊断。此外，该联盟为开发具有转化潜力的液体活检生物标志物提供了建议和最佳实践。来自六个受资助机构的项目集中开发新工具/方法/分析和/或验证涉及捕获循环体液中的DNA、RNA或EV的现有技术。

图1. 文章摘要图。

1.基于液体活检的癌症早期检测的潜力

液体活检的进步主要基于几个关键事实。虽然乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肺癌和前列腺癌的影像学和血液筛查是可行的，但筛查并没有统一应用。患者的依从性反映了筛查工具的可用性、耐受性和发病率。   

对于肿瘤学家来说，生物体液中肿瘤来源标志物的表征已成为识别肿瘤特异性基因扩增和突变的有力方法，其目的是实现快速、非侵入性且经济高效的癌症诊断、疾病状态和治疗反应监测。多种液体活检方法已被开发用于在无需对器官类型进行分类的情况下，对大量人群进行“一般”癌症筛查诊断，对处于“危险中”的无症状个体进行癌症早期检测，对临床试验中的治疗队列进行分层，提供基于分子的肿瘤分期，检测治疗后微小残留疾病，以及检测治疗反应或治疗后疾病复发。

2.当前筛查模式面临的挑战

癌症是一种多样化的疾病，可以起源于人体基本所有的细胞类型和器官，有超过100种具有不同危险因素和流行病学特征的不同种类。当前的筛查研究侧重于在癌症最可治疗时识别前驱病变或恶性肿瘤，制定最有效的治疗方案。但这些筛查方式往往存在挑战。液体活检有潜力弥补这些缺陷并补充现有的筛查检测，从而提供更有效的诊断平台（图2）。

图2. 液体活检联盟概览及所研究的不同技术。

3.联盟提出弥补癌症早期检测不足的液体活检方法  

研究团队针对乳腺癌、肺癌、卵巢癌等癌症开发了液体活检技术。

目前，乳腺癌主要使用乳房x光检查进行早期筛查，并通过病理评估做出明确诊断。已有研究证明，分离和分析CTC的技术可用于乳腺癌的早期检测。例如，由华盛顿大学Cote博士团队与Circulogix合作开发的微滤技术CyteCatch，可用于收集、量化和分析早期乳腺癌患者血液中的CTC和肿瘤微环境细胞，如癌症相关成纤维细胞。

对于肺癌，目前主要使用低剂量螺旋CT进行早期检测。但该方法存在高假阳性率、辐射暴露等不足。研究显示，有可能利用循环肿瘤DNA（ctDNA）来检测常见的肺癌生物标志物。例如，加州大学洛杉矶分校Wong博士团队开发了EFIRM液体活检技术，用于检测非小细胞肺癌患者血浆和唾液中ctDNA和miRNA中的10种最常见DNA突变。EFIRM技术可以直接在体液中快速、无创地检测靶标分子，无需预先提取。此外，Wong团队研究了这种技术在检测超短ctDNA（<60bp）片段中的应用。该团队已经与Liquid Diagnostics公司合作开发和验证了该技术，并将其转化为临床应用。

对于卵巢癌的筛查，目前使用的血清生物标志物（CA-125）具有低预测值（5%）和高假阳性率。基于液体活检的EV评估可以成为卵巢癌早期检测和治疗监测的新方法，从而提高患者总生存率。例如Lee博士团队通过卵巢癌外泌体分析纳米等离子体项目，该研究侧重于EV分离方法的标准化和通过高通量纳米等离子体平台（nPLEX）对EV进行蛋白质组学分析。

液体活检在难以获取样本的癌症诊断中也可能是有益的，例如脑瘤。在影像学检查结果不确定的情况下，CSF或血液中DNA/RNA突变的存在或有助于肿瘤的诊断或识别术后残留疾病。CSF或血液标志物（EV RNA/DNA、CTCs、cfDNA）的靶向测序也可以避免开颅手术以获得组织样本来识别可操作基因突变的需要。最后，液体活检取样的最小侵入性允许脑瘤的纵向监测。

此外，约翰霍普金斯大学Papadopoulos博士领导的NGS拷贝数变异分析可以灵敏地检测ctDNA，用于检测结直肠癌、头颈癌和脑癌。此外，耶鲁大学Patel博士团队开发了计算模型来整合ctDNA的表观基因组和分子特征，用于区分良性肺结节和恶性病变。

4.液体活检标志物

液体活检的多种生物标志物可以在不同水平提供肿瘤的遗传信息，在不同的生物体液中，以不同的灵敏度和特异性检测疾病特异性生物标志物。目前，研究最多的生物标志物包括ctDNA、EV和CTC。

ctDNA是释放到体液循环中的肿瘤来源DNA片段，是研究肿瘤特异性突变、CNV、甲基化变化或整合病毒序列的有吸引力的标志物。已有证据表明，ctDNA在75%以上的晚期胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌和头颈癌患者中可以检测到，在不到50%的原发性脑癌、肾癌、前列腺癌或甲状腺癌患者中可检测到。

从体液中分离的ctDNA浓度很低，检测罕见的突变事件更具挑战性。有时需要使用较高的样本体积来分离足够绝对量的ctDNA，用于检测肿瘤特异性突变。体液的选择也是一个重要的变量。使用替代的体液样本可以潜在地允许早期检测在血液中难以检测到的癌前病变，对于通过血脑屏障与体液循环分离的CNS肿瘤来说尤其如此。此外，ctDNA高度片段化，有时长度低至50bp，需要高度敏感的技术来检测和量化非癌细胞释放的cfDNA背景中的肿瘤特异性基因突变。    

CTC是完整的癌细胞，由原发肿瘤释放到体液循环中，并被认为具有转移潜力。目前，尚不清楚CTC是否仅仅是肿瘤的分离亚群，或者是可随机抽取代表整个肿瘤。CTC非常罕见，很难分离，产量也可能随着肿瘤的发展而变化，在早期疾病中敏感性较低，在晚期疾病中可分离出更丰富的CTC。

克服这一问题的一个潜在方法是使用大量的体液样本来实现最佳产量。捕获CTC方法包括流式细胞术、免疫磁性或基于粘附的方法等。另有一些先进方法正在开发，例如华盛顿大学首席研究员Cote博士联合迈阿密大学医学院和加州理工学院团队，正在开发收集、量化和分析早期乳腺癌患者CTC和肿瘤微环境细胞的平台。微过滤器技术CyteCatch与自动化流体平台faCTChecker联合，从血液和其他生物体液中捕获并分离这些稀有的靶标细胞。捕获的细胞通过芯片进行图像分析，这些图像最初被用作训练集来训练深度学习算法，随后将被用于该过程的自动化。

EV是从细胞（包括肿瘤细胞）释放出来的膜状结构，含有核酸（DNA、mRNA、miRNA、非编码RNA）、蛋白质、脂质或其他代谢物。EV涵盖了一系列广泛的分泌囊泡，包括微囊泡、外泌体、胞外体和癌小体。EV被证明能调节肿瘤增殖、重新编程代谢活动、诱导血管生成、逃避免疫监视、获得耐药性和经历侵袭，可作为包括肿瘤在内多种疾病的有潜力的诊断和预后生物标志物。

EV主要在疾病诊断和监测中发挥作用，很多研究都利用EV来开发灵敏且特异的突变检测方法。已有多项研究在包括非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌和鼻咽癌在内的多种癌症中探索了使用血源性EV作为诊断工具。不同生物体液中EV包容物的异质性与疾病部位密切相关，其中从尿液中分离出EV可获得更高的诊断准确性。目前报道的方法和技术大多采用了批量EV方法，可提供关于异质EV群集合的信息，但在单个EV水平上的分析对于识别疾病衍生的潜在生物标志物具有巨大的价值。

5.体液病理学 

新一代靶向治疗方法和个性化肿瘤学实践已将许多类型的癌症从与急性死亡率相关的疾病转变为需要持续监测的更慢性疾病。因此，癌症诊断亟需类似于用于筛查和管理其他慢性疾病（如糖尿病和心血管疾病）的方法和检测平台（即低成本、微创、护理点检测）。

图3. 癌症的发病率和死亡率及“液体活检”相关出版物。

近年来，随着NGS技术、蛋白质组学的巨大进步，以及对血液生物标志物用于疾病诊断了解的不断深入，曾经局限于组织的病理分析越来越多地开始从微创外周血采样中进行。突出的例子包括，通过肿瘤分型以确定可能的治疗靶点。这些进步导致了一个新兴的基于液体的诊断领域，我们称之为“液体活检”，包括基于血液的治疗效果检测和早期复发/微小残留疾病检测，可以比标准临床方法更早地报告结果，以及最近令人兴奋的应用——癌症早期检测，使我们能够在更早、可治愈的阶段检测到致命癌症。

不同癌症中研究的主要标志物见表1。虽然最初的重点仅限于CTC的检测和定量，但新技术使我们能够对细胞进行更深入的分析，包括细胞和分子组成。同时，我们也正在进入一个细胞形态分析的新时代，在显微镜、图像采集和使用深度学习/人工智能的图像分析方面的先进技术提供了细胞分析方法。这些方法在我们如何评估癌症以及许多遗传性疾病方面创造了一种范式转变。虽然体液病理学一直是现代医学诊断的重要组成部分，但我们显然正在进入一个令人兴奋的新时代，在这个时代，我们可以做得更多，了解得更多，干预更快，更有效，侵入性更小，安全性更高，使用的血液样本更少。

表1.脑癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌中基于液体活检的分析技术综述

6.多标志物和多癌早期检测（MCED）

虽然通过液体活检进行单一标志物检测很实用，但仍然存在高灵敏度和特异性方面的障碍。因此，在过去十年中，开发多标志物早期检测获得了青睐。通过同时识别多种生物标志物，可以提高突变检测的灵敏度，并且有可能揭示治疗抗性基因。

临床纳入MCED血液检测将允许检测源自不同组织的多种癌症。这种有希望的一步检测有可能在早期和更容易治疗的阶段诊断出肿瘤。临床应用MCED的例子包括Galleri、CancerSEEK和OneTest。Galleri是一种针对50岁以上癌症风险较高的人群的多癌筛查检测，是基于cfDNA并检测肿瘤特异性甲基化模式来预测起源组织。Galleri可以利用该信号潜在地筛查50多种起源于多器官系统的癌症类型（肾脏、肺、肾上腺、胃肠道、口腔等）。CancerSEEK平台已经开发出来，利用从血液中分离的cfDNA来检测8种独特的蛋白质和致癌突变，并筛查9种癌症。OneTest是一种使用机器学习和蛋白质组学的集成算法，使用成熟的生物标志物筛选6种癌症。重要的是，这些筛查试验已在包括不同人群的大规模多机构队列中得到验证，是在早期可治疗阶段实现癌症筛查的重要里程碑。

多平台组合可以提供更全面的肿瘤状态窗口信息。但随着这些诊断检测的发展，仍然存在检测结果不一致的情况。最大限度地减少假阳性对于区分低患病率标志物信号和噪声非常重要。此外，结果的分析和注释需要标准化且可重复。机器学习和人工智能的进步将有助于多标志物血液检测的进一步发展和进步，以预测疾病进展。

7.应对基于生物标志物液体活检的挑战

虽然可用于临床诊断的大量潜在生物标志物不断被发现，但只有不到1%的标志物成功进入临床实践。这与生物标志物从发现到临床应用不同阶段的几个瓶颈有关，例如可重复性有限、分析前误差和分析后误差。

首先，研究人群选择是研究设计中的一个重要步骤。初始研究设计中的缺陷会在报告的结果中引入偏差。除了广泛的交叉验证，敏感性和特异性应在某些疾病严重程度不同的患者群体中进行评估。

其次，确定和评估生物标志物在疾病诊断和管理中的潜在作用很重要。一些新发现的生物标志物可能对肿瘤具有特异性，但在实际临床实践中缺乏实用性。这可能是由于这些标志物在临床决策中的作用有限或对治疗决策的影响极小。

分析前阶段是液体活检工作流程的重要阶段。缺乏标准化的工作流程会导致不同的发现。关键的分析前变量包括样本采集、分离方法、样本处理、下游检测平台和短期及长期储存的生物库。   

最后，必须解决数据分析中偏差的来源，包括由控制选择不当和统计误差引起的系统偏差。不恰当的统计方法会导致不正确的结论。此外，使用预先定义的训练和验证数据集进行多次比较有助于理解和确定研究人群的变化。

为了提高液体活检在临床实践中的应用前景，需要更多地关注研究设计和检测阶段的众多挑战。这种方法与严格的外部和内部验证检测相结合，是未来生物标志物开发的重要下一步。

表2.常见的分析问题及建议

8.与行业的合作

液体活检诊断方法的商业化引起了广泛关注。仅在美国，该领域代表的市场机会估计至少为300亿-1300亿美元，大型企业包括GOOGLE Verily、Roche Holdings、Guardant Health、Illumina和FoundationOne。该市场仍未充分渗透，特别是在罕见病、敏感的新方法和临床上强调协同努力的学术-商业互动方面。NCI癌症预防部在创建LBC时强调了这些学术-商业伙伴关系。

总的来说，大多数公司已经开发出了使用血液或血浆的诊断方法：GRAIL、THRIVE、Bioprognos、DELPFI、EARLYDx、Helio/LAM、Nucleix和Volition。此外，学术研究已经探索了可能与患病器官更接近的体液：唾液和痰（口腔癌和咽喉癌）、痰（肺癌和胃肠道癌）、尿（泌尿生殖系统癌）、CSF（脑肿瘤和退行性神经系统疾病）和精液。

学术与商业的合作更加新颖。学术与商业合作可以通过验证有潜力的生物标志物来促进发现，从而加速临床转化。学术实验室可以推动技术发展和生物标志物发现，提高检测性能，并确定目标人群。反之，企业可以推动工艺开发、成本降低、自动化、预分析、分析验证和大型试验。因此，学术界的知识和科学灵活性与商业的组织和能力相结合，有助于简化基于液体活检的生物标志物开发框架。

9.该领域的其他重要努力

鉴于液体活检在疾病检测和监测中的临床实用性，许多国际协会和联盟已经开始对相关生物标志物分离和下游分析中确定的关键变量进行标准化。有针对性的国际合作是实现标准综合协议的重要一步。例如，由欧盟委员会Marie Sklodowska-Curie计划资助的欧洲液体活检学会（European Liquid Biopsy Academy），专注于开发基于血液检测I–IV期非小细胞肺癌的方法，涵盖了四种不同类型标志物（CTC、EV、ctDNA、肿瘤诱导血小板）单独和组合分析技术的开发和验证。

BLOODPAC是美国癌症登月计划的一部分，旨在加速液体活检的开发和临床转化。早期检测研究网络（EDRN）由美国国立卫生研究院创立，是一个由300多个学术界和商业合作伙伴组成的联盟。EDRN有四个组成部分（生物标志物开发、生物标志物参考、临床验证和数据管理），它们协同工作，促进早期癌症检测生物标志物的开发。

10.未来展望

液体活检可能会彻底改变我们未来检测和治疗癌症的方式。如文章所述，液体活检分析包括多种标志物，如DNA、蛋白质、cfDNA中的代谢物、CTC和EV。未来的研究需要确定一个生物学问题，即基于液体活检对已知的病因、类型、范围或cfDNA/ctDNA的结构以及结构背后机制的分析确定哪种癌症类型可以从中受益。除了先前报道的ctDNA释放机制（凋亡、坏死）之外，导致不同的ctDNA片段化模式的活性分泌也在研究之列。在由组蛋白形成的核小体核心中，ctDNA被保护免受核酸酶的切割，但位于核小体之间的剩余linker ctDNA序列非常脆弱。因此，这解释了为什么不同的区域显示出或高或低的生物片段化频率。这种现象导致了ctDNA序列的表达偏好和不平衡的read覆盖。此外，我们需要探索可以添加到现有技术中的技术，以提供更好的采样方法，提高较小样本（目前需要5-10mL样本）的检测水平，并提高信噪比（例如，染色质免疫沉淀会对基于突变的液体活检分析产生突变背景噪声）。

目前，在临床上使用液体活检的主要障碍是缺乏验证该技术的前瞻性纵向队列。我们需要调查现有队列中可用样本的质量和数量，以及基因组、蛋白质组学和表观基因组学分析中的样本适用性，并评估这些队列的质量控制，以保持多年的样本质量和获取相关指南。有必要解决对报告液体活检标准化有关键影响的多个分析前变量。

同时，我们需要创造性地思考前瞻性研究设计，以解决液体活检在改善癌症分期转移方面的应用，最大限度地减少不必要的侵入性诊断检查，提高检测效率，并提供与标准护理相媲美的信息。液体活检技术的目标应该是开发成本效益高、严格的诊断检测，与市场互补。因为液体活检技术在不断发展和完善，所以与医疗卫生人员合作是一种谨慎的做法。

LBC正在与基金会、商业和学术界等多方合作解决上述挑战。我们的目的不是坚持单一方法，而是促进多种循环生物标志物与多种癌症的多种分析物的协同应用，确定识别癌症存在的标志物组合。联盟正在考虑使用多种方法来检测循环肿瘤生物标志物，包括可用于监测肿瘤微环境和免疫细胞，这可能有助于开发靶向治疗。

原始出处：

Batool SM, Yekula A, Khanna P, et al. The Liquid Biopsy Consortium: Challenges and opportunities for early cancer detection and monitoring. Cell Rep Med. 2023;101198. doi:10.1016/j.xcrm.2023.101198https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(23)00365-8