结合NGS和传统诊断结果，可实现3-4级胶质瘤的诊断更精准，并提供潜在靶向治疗

成人神经胶质瘤在遗传学、表观遗传学、表型以及临床预后方面差异显著。因此，实现更精确诊断并影响治疗选择的最佳肿瘤分类至关重要。靶向二代测序（NGS）是一种高度可靠和高效的新型工具，可用于识别诊断中枢神经系统（CNS）肿瘤的生物标志物。本研究旨在确定将NGS结果与传统诊断数据相结合对临床诊断和患者管理的影响。收集2019至2020年在该院诊断为脑胶质瘤，并同时采用传统组织形态学和免疫组化（IHC）诊断技术以及二代测序技术对肿瘤活检样本进行检测的所有患者。患者信息从电子病历中检索。分析的数据包括组织病理学诊断、肿瘤分级、ki67、TP53和/或IDH突变状态，以及部分患者的其他基因如BRAF和HER2。评估NGS与传统诊断工具对IDH和TP53突变的总体一致性。此外，研究者利用Kaplan-Meier估计值得出了患者的总生存期。研究者确定了9例3-4级胶质瘤患者，他们的活检样本通过NGS和传统诊断工具进行分析。本研究患者中33.3%为女性，诊断时的中位年龄为43岁。与IHC比较，NGS检测IDH突变和TP53突变的一致性分别为77.8%（7/9）和55.6%（5/9）。NGS进一步改变了患者治疗，其中1例（11.1%）BRAF V600E突变星形母细胞瘤患者接受了循证靶向治疗（达拉非尼+曲美替尼）。将NGS与传统诊断工具相结合用于神经胶质瘤的诊断对患者具有重要意义。这种整合诊断可以使诊断更加精确，增强分子标志物的识别，并为患者提供靶向治疗的潜力。

• 将靶向二代测序（NGS）与传统诊断工具相结合，可以实现更精准的诊断，增强对分子标志物的识别，并为患者提供靶向治疗的潜力；

• 研究者应用NGS结果进行的综合分析导致了患者管理的变化，其中一名BRAF V600E突变阳性星形母细胞瘤患者采用了循证靶向治疗；

• 因此，将NGS结果与传统的诊断工具相结合可以对胶质瘤患者产生深远的影响。

研究背景

胶质瘤是影响成人患者的最常见原发性脑肿瘤类型，因其在遗传学、表观遗传学、治疗反应和临床结局方面的异质性而闻名。近年来，随着遗传和表观遗传分析方法（例如NGS和基于DNA甲基化的分析）的进步，中枢神经系统肿瘤的分类不断发展。2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类首次引入了分子生物标志物对于脑胶质瘤诊断和分类的关键作用。将肿瘤的组织学特征（即肿瘤类型和分级）与肿瘤的分子分型相结合，可以对不同的肿瘤类型及其亚型进行更精确的诊断和分类。例如，少突胶质细胞瘤的诊断是基于IDH突变以及1p/19q共缺失的存在。与2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类一样，2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类第五版进一步强调了综合诊断的关键重要性，并强烈鼓励将免疫组织化学等传统诊断工具与新型分子工具相结合。

整合有关肿瘤组织病理学和分子特征的信息可提供更准确的临床诊断，特别是对于罕见的、不典型的肿瘤和组织学上可能与其他肿瘤相似的肿瘤。这样的肿瘤分类对于患者的最佳管理是必不可少的，并可能有助于选择适当的治疗方式，包括靶向治疗的潜在使用。做出准确的诊断至关重要，因为这将影响患者的预后、可使用的治疗模式，从而影响患者的整体管理。

与传统的肿瘤病理分型相比，肿瘤的分子分型可通过聚焦于特定基因突变的免疫组织化学、荧光原位杂交（FISH）、微卫星分析以及基因测序来实现。因此，NGS是一种创新的技术进步，已被应用于胶质瘤的临床诊断。已应用于胶质瘤诊断的新型高通量测序技术包括DNA甲基化分子谱分析、胶质瘤相关基因panels和全外显子组或全基因组测序。在不同类型的NGS中，靶向测序，如基因panels，提供了一种高效和经济的工具，可以分析特定的预先定义的相关基因变异。从本质上说，NGS为精准医疗提供了一种方式，通过影响临床诊断过程、预测患者预后（如识别预后生物标志物）以及指导治疗（如靶向治疗）等方式，提高了我们对胶质瘤分子基础和患者整体护理的了解。

NGS具有几个关键优势，使其在临床常规诊断中具有高度可行性。靶向NGS具有高灵敏度，能够以合理的成本同时高效地检测多个基因变异。因此，单次分析可以提供关于脑胶质瘤中重要的诊断、预后和预测性基因变异的信息。NGS还可以利用福尔马林固定的石蜡包埋组织和活检样本，并且需要少量DNA即可进行适当分析。此外，NGS提供了预先的诊断信息，导致更精确和准确的诊断，因此减少了与额外的传统检测和不必要的治疗相关的成本。

在一项评估NGS在美国565例神经肿瘤患者临床应用的最大研究中，其中484例患者被诊断为弥漫性胶质瘤。与传统的分子诊断工具（如IHC、FISH、PCR）相比，NGS在检测重要突变方面具有高度的可靠性。在荷兰的一个中心，自2013年以来，NGS检测已常规用于诊断弥漫性胶质瘤。有研究使用检测弥漫性胶质瘤中常见基因突变、基因扩增和拷贝数变异（CNAs）的检测panel，回顾性分析了来自432例患者的434份样本。在他们的样本中，仅NGS就成功诊断了87.1%的病例，其中近28%的病例有不同的诊断。此外，NGS 还检测出肿瘤中的BRAF突变，根据其组织学诊断，这些突变发生的可能性较低。最后，这项研究证明了NGS对17/22个肿瘤进行分子诊断分类的卓越能力，这22个肿瘤根据其组织学诊断尚未明确诊断。NGS可以检测标准IHC通常无法检测到的罕见非经典突变，如非经典IDH1、IDH2、TP53等。在一项研究中，仅检测到非经典TP53突变就导致了8%的分析肿瘤进行诊断重新分类。另一项使用NGS基因panel分析成人胶质瘤的研究显示，在所有163个胶质母细胞瘤中，67%的基因变异可被FDA批准的治疗药物靶向。

在土耳其NGS技术的使用目前还不是肿瘤学实践标准指南的一部分，特别是在患者管理和应用治疗方面。虽然在土耳其，NGS在实体瘤诊断中的应用多年来已经扩大，但在胶质瘤方面的应用仍然非常有限。NGS的应用有限可能是由于多种因素造成的，包括全国癌症研究所缺乏先进的基因实验室以及成本。这项研究旨在确定将NGS结果与组织病理学数据相结合对胶质瘤患者的临床诊断和管理的意义。

研究方法

在这项回顾性研究中，研究者纳入了2019-2020年在Bahcesehir大学医学院Goztepe医院（土耳其伊斯坦布尔）被诊断为胶质瘤的患者。所有患者的肿瘤活检样本均进行了传统的组织形态学和免疫组织化学诊断以及NGS技术分析，用于NGS的试剂盒包括FoundationOne®CDx和Sophia Genetics®。从患者病历中提取的数据包括人口学资料（如诊断时的性别和年龄）；组织病理学诊断、解剖定位和分级；免疫组化结果，包括p53、IDH-1、ATRX等多基因突变和Ki-67（%）；微卫星不稳定状态；以及一些患者的其他检测结果（如HER2检测）。将IHC与NGS进行比较时基因突变检测结果相同或不同的患者的平均值分别计算一致性和非一致性。所有基因突变检测结果，无论是突变型还是野生型均纳入计算。22.2%（2/9）的患者接受了FoundationOne®CDx检测，该检测可检测324个基因的突变/变异。其他使用的NGS工具包括Sophia Genetics®实体肿瘤基因panel，以及使用Illumina Nextseq550的NGS panel（包括486个基因）。

研究结果与讨论

在这项基于单一机构的回顾性研究中，研究者确定了85例3-4级脑肿瘤患者。在这些患者中，研究者进一步确定了9例（10.5%）3-4级胶质瘤患者，这些患者的活检样本同时进行了传统的IHC和FISH诊断检测以及NGS分析。33.3%的患者为女性，平均诊断年龄为43岁，范围为25至65岁（表1）。大约56%的患者被诊断出患有胶质母细胞瘤（WHO 2016，IV级），其解剖位置位于右顶叶、右额颞叶、右枕叶、左额叶或枕顶叶区域（表 1）。其他诊断为间变性星形细胞瘤（WHO 2016，III级）、星形母细胞瘤（WHO 2016，III级）、髓母细胞瘤（WHO 2016，IV级）和间变性弥漫性胶质瘤（WHO 2016，III级）。研究者根据最新的2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类对这些诊断进行了重新分类，如表1所示。

表1

对于IDH突变和TP53突变，NGS和IHC的一致性分别为77.8%（7/9）和55.6%（5/9）（图1）。文献显示，IDH突变的一致性最高，ATRX突变和EGFR扩增的一致性相对较高。一篇综述表明IHC和DNA测序鉴定IDH1突变的一致性为88%-99%。在最近发表的一篇关于弥漫性胶质瘤基因panel的文章中，发现IDH1突变检测的一致性最高（灵敏度100%；特异性98.11%），对ATRX突变检测的灵敏度较低，对TP53突变检测的灵敏度也较低。在本研究中，IHC和NGS检测TP53突变的灵敏度（80%）和特异性（90%）相似，但在另一篇文章中报道的灵敏度和特异性分别为75%和63%。根据几项研究，IHC和Sanger测序检测p53突变的一致性在59%-89%之间。在一项使用靶向NGS分析529例成人胶质瘤患者的研究中，TP53的一致性计算为67%。本研究结果符合文献中已发表的TP53突变的总体一致率性范围，计算的一致性接近56%。TP53的低一致性可能是由于免疫组织化学的高假阴性，阴性的免疫染色可能被错误地解释为野生型。不一致的其他原因包括IHC通常不能检测罕见突变（如无p53核聚集的截短突变）的局限性。对于ATRX，据报道ATRX表达缺失的一致性为76%，而没有检测到ATRX突变的灵敏度为98%。在本研究中，ATRX的一致性为28.6%。

图1

在本研究患者中，NGS分析发现了IDH、BRAF、TP53突变，以及EGFR扩增和CDKN2A/B缺失等（表2；图2）。具体的基因变异列在表2中。例如，胶质母细胞瘤患者，IDH野生型（病例2），有TP53 P190L，c.569C＞T突变，变异丰度占23.2%。该突变表明在核苷酸569处发生了特异性替换，导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。根据美国国立医学图书馆的ClinVar，除了TP53 P190L突变目前列为可能致病性，检出的TP53 E258K、TP53 R282W和IDH1 R132H突变被归类为致病性/可能致病性。重要的是，在病例1中发现的基因变异，即CHEK2剪接位点445-1G>A，也被发现可能具有致病性，并且可能与家族性乳腺癌和遗传性癌症易感综合征有关。CHEK2基因的其他变异在文献中没有发现，提示这可能是先前在胶质瘤中未识别的基因变异。其他基因突变（如PTEN G156）的意义尚不确定。需要强调的是，MTAP和CDK2NA/B缺失被发现与胶质母细胞瘤，IDH野生型患者较差的生存率相关。另一方面，EGFR过表达可被认为是脑胶质瘤患者的不良预后生物标志物。

表2

图2

此外，NGS数据显示本研究的1例患者（11.1%）存在TP53突变，而IHC未发现该突变。TP53和IDH突变患者的生存曲线如图3、图4所示。研究者在3例患者（分别被诊断为髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤和星形母细胞瘤）中发现了BRAF突变。在其中一例患者中，NGS分析发现BRAF V600E突变，而IHC未发现该突变。在本研究的星形母细胞瘤患者中，IHC和NGS均检测到BRAF突变。

图3

图4

最近发表的一项来自13个国家27个癌症研究所的新型临床试验（包括45例高级别胶质瘤患者和13例低级别胶质瘤患者）指出，使用达拉非尼和曲美替尼对BRAF突变阳性胶质瘤有活性，且与亚型无关。对于本研究的BRAF V600E突变型星形母细胞瘤患者，研究者使用了达拉非尼联合曲美替尼，这一联合疗法已被证明可以延长BRAF V600E突变阳性的转移性黑色素瘤患者的生存期。因此，对于接受标准治疗后星形母细胞瘤进展的患者，NGS支持使用靶向治疗。这凸显了NGS在检测可靶向的基因方面的卓越能力，从而影响患者在适当的时候可接受的治疗。

近年来，由于神经胶质瘤极其罕见等多种原因，神经胶质瘤的治疗很少取得进展。遗憾的是，目前对于接受标准化疗方案后发生进展的低级别CNS肿瘤患者，可选择的治疗方案非常有限。因此，通过NGS找到一个可干预靶点可能会显著影响患者的生活。在一项研究中，在67%的胶质母细胞瘤中检测到潜在的分子靶点。虽然IHC可以检测到BRAF突变等突变，但NGS可以发现传统诊断方法无法检测到的突变。在最近发表的一份报告中，NGS在1例神经节细胞胶质瘤中鉴定出BRAF V600E，其变异丰度仅为2.5%，提示这一变异丰度可能是IHC未检测到该突变的原因。这凸显了NGS在识别低变异丰度基因突变方面的作用。NGS可同时和容易地识别多个基因变异，从而更早、更有效的进行诊断和治疗，避免了延误和不必要的成本。

局限性

虽然本研究受到样本量小的限制，但为NGS在3-4级胶质瘤临床诊断和治疗中的应用提供了有价值的见解。本研究强调了NGS在支持使用靶向治疗方面的关键作用，靶向治疗可以显著影响患者的预后和生存。研究者还强调了在土耳其中，NGS在胶质瘤患者中的应用有限。在本研究中，9/85例患者被诊断为3-4级胶质瘤，且这9例患者的肿瘤样本进行了NGS分析。这代表了本研究的患者人群的10.6%，强调了更广泛地使用NGS来进一步提高胶质瘤患者的精确诊断和管理的迫切需要。

值得注意的是，目前有不同的NGS方法和工具用于诊断，每种方法和工具都有一组预定义的基因panels（范围从20到超过500），以及其用于检测特定基因突变和变异的灵敏度和特异性。在本研究患者队列中，并非所有患者的肿瘤样本均采用相同的技术进行分析。作为本研究的一部分，研究者回顾了FoundationOne CDx（旨在检测324个基因）和Sophia Genetics（旨在检测486个基因）的分子分析。不同基因panels和二代测序技术的可用性凸显了评估和比较不同新型诊断工具性能水平的必要性，以阐明最优panels用于临床。

在这项回顾性研究中，BRAF V600E突变阳性星形母细胞瘤患者证明了NGS如何支持使用基于证据的靶向治疗，该患者在标准治疗后发生疾病进展。因此，将NGS结果与传统的组织病理学和分子工具相结合用于胶质瘤的诊断将对患者产生深远的影响。这样的综合诊断可以导致更精确的诊断，增强分子生物标志物的识别，并为胶质瘤患者提供靶向治疗的潜力。

参考文献：

Duaa Kanan, Şebnem Safi, Tarek Kanan, Serkan Çelik, Bala Başak Öven, Özlem Yapıcıer, Integrated diagnosis of grade 3-4 gliomas using targeted next-generation sequencing and traditional diagnostic data, and its overall implications on patient management, Brain Disorders, Volume 14, 2024, 100126, ISSN 2666-4593, https://doi.org/10.1016/j.dscb.2024.100126.