应用高通量多重蛋白组学，筛选疾病生物标记物；找到了阿尔茨海默病的脑脊液特异性变化

关键词：阿尔茨海默病；生物标记     

引言：

• 创新性新技术总会引领一系列临床科研的进步。

• 把握住生物医学技术的进展，有利于更高效、高质量地解决自己临床科研中的问题。

• 本期推送的即为应用高通量多重蛋白组学，筛选疾病的生物标记。

阿尔茨海默病（AD）是最常见的与年龄相关的神经退行性痴呆，占痴呆患者的60-80%，其他常见的痴呆类型包括路易体痴呆(DLB)和额颞叶痴呆(FTD)，其症状和病理学常与AD重叠，因而导致高达30%的误诊。

几项独立的临床前和遗传研究表明，AD可能由多种因素如免疫、脂质代谢、血管功能障碍和内吞途径等共同引起，而脑脊液（CSF）可以提供这些有效信息。AD的标志物如Aβ42、Aβ42/40、磷酸化tau(pTau)和总tau(tTau)可以分别反映特征病理学改变如斑块沉积、神经原纤维缠结形成和轴突变性情况。

然而，这些标志物并不能有效区分AD和其他非AD痴呆症。因此，有必要对CSF蛋白质组的详细研究，从而寻找反映AD病理学改变的新的标志物，并为针对不同机制的临床试验的潜在治疗靶点和替代终点开辟新的理解。

2022年11月，阿姆斯特丹大学医学中心的Marta del Campo团队在Nature Aging杂志在线发表了题为“CSF proteome profiling across the Alzheimer’s disease spectrum reflects the multifactorial nature of the disease and identifies specific biomarker panels”的论文。

本研究中，研究者使用新的高通量多重蛋白组学平台--基于免疫的邻近延伸测定（PEA）测定了来自轻度认知功能障碍且具有异常Aβ（MCI(Aβ+)：n = 50）、AD痴呆（n = 230）、非AD痴呆（n = 322）和认知未受损的对照个体（n = 195）的797个CSF样本中的665种蛋白质。他们的主要目标是定义AD发病机制背后的新CSF蛋白质组学变化，次要目标是识别和验证有助于早期和特定生物学定义AD的生物标志物，作为对当前核心生物标志物的补充。

下面我们将对这篇文章的研究内容和主要结论进行简要概述。

研究内容及结果

1. 各组之间的CSF蛋白组学差异

研究人员首先评估了哪些蛋白质在MCI(Aβ+)或AD患者与对照组之间有不同的调节，发现112个差异CSF蛋白中的92个在MCI(Aβ+)中上调，排名前五的差异调节蛋白功能分别涉及蛋白糖基化（ENTPD5），氧化应激（PARK7），溶酶体功能（PRCP, DPP7）和免疫系统（CRTAM），288个差异CSF蛋白中的281个在AD痴呆组上调，前五种涉及细胞骨架和细胞外重塑（ABL1、TMSB10和MMP-10）、外泌体组装 (SDC4)和免疫系统(ITGB2)。

为了研究AD特异性相关蛋白，研究者比较了AD和非AD痴呆之间的CSF蛋白表达，469种差异蛋白中的大多数蛋白在AD组上调，只有16种在AD组中水平较低，前五种差异调节蛋白参与的细胞过程主要包括细胞骨架重塑 (ABL1)、能量代谢过程 (ENO2)、神经肽降解 (THOP1)、氧化应激 (DDAH1)和血管功能 (RSPO3)。

图1. 本研究流程示意图（a）以及各组脑脊液蛋白丰度差异（b-d）。

2. 各组之间独特且重叠的蛋白质

那么上述确定的差异蛋白是临床AD阶段（MCI(Aβ+)和痴呆）特有的吗？

进一步比较发现，在AD和对照组之间差异调节的281种独特蛋白质中，大多数仅在AD痴呆阶段异常（n =189），22%（n = 63）在MCI(Aβ+)患者中也失调，41种蛋白在MCI (Aβ+) 中失调，但在 AD 痴呆中没有失调，表明每个疾病阶段可能具有独特的 CSF 特征，蛋白质失调遵循不同的沿疾病过程的轨迹。

在AD与对照的比较中，89%(n=252)的蛋白质在AD和非AD痴呆之间也发生了变化，其中只有一种蛋白质（DDC）在非AD组中比在AD组中失调更为显著，这一发现表明绝大多数已鉴定的蛋白质在AD中特异性失调。少量蛋白在MCI(Aβ+)和AD中失调与在非AD痴呆患者中观察到的水平相当（n=29)，这些蛋白可能代表神经变性的一般生物标志物。

基于上述发现，研究者想知道在特异性AD阶段失调的蛋白质所代表的生物学过程，通路分析显示MCI(Aβ+)和AD痴呆中失调的蛋白质反映了与活性氧代谢过程、蛋白质复合物组装、自噬、神经递质转运、Wnt信号通路、周围神经系统发育、能量代谢、肽基丝氨酸相关的生物过程磷酸化和一氧化氮生物合成过程。

图2. 差异调节的CSF蛋白沿AD谱变化并能反映不同的生物学过程。

3. CSF差异蛋白可实际用于区分MCI (Aβ+)和AD与对照组或非AD痴呆

为了确认是否能将上述发现转化为常规诊断和临床试验的实用生物标志物工具，研究者进行了分类分析和内部交叉验证以确定对AD具有最大鉴别能力且需数量最少的CSF标志物。

结果显示一组8种CSF蛋白能以非常高的准确度区分AD和对照个体（图3和表1）。除 THBD 和 SPON2 外的所有蛋白质都显示出与经典 AD CSF 生物标志物或MMSE评分（简易精神状态检查表）的弱至适度相关性，TGB2、ABL1和MMP-10分别是显示与CSF Aβ42和tau以及MMSE评分最强关联的标记。研究者使用埃默里大学的独立队列进行的外部验证表明该模型可以以高精度区分AD患者和对照组，也能以良好的性能区分MCI(Aβ+)和对照组，但在区分AD和非AD表现较差。

研究者进一步使用相同方法构建一个包含9种CSF蛋白的组合，能以更好的性能区分这些痴呆类型（原文表2和图3），与对照和非AD痴呆相比，大多数蛋白（ABL1、THOP1、ENO2和DDC）在MCI (Aβ+)和AD阶段都高度失调，他们还发现了AD和非AD痴呆之间具有适度差异或无显著差异的蛋白如MMP7、VEGFR-3和PTK7。

图3. 脑脊液生物标志物用于AD的早期和特异性诊断。

原文表2. 经十折交叉验证后，为每个特定诊断面板选择CSF标记物。

4. CSF蛋白组的验证

为了验证 CSF 蛋白组的性能，研究者进一步开发了定制的多重PEA用于测量上面表1中两个AD诊断组的15种蛋白质，其中12种用于最终测定。

在独立的多中心验证队列中显示AD和对照组或非AD痴呆组之间的蛋白倍数变化与发现队列中获得倍数变化密切相关，支持研究结果的有效性（分别为 r = 0.80和0.86）（上图3e）。但当研究 MCI(Aβ+)与对照时，验证步骤中的蛋白质效应大小与发现阶段的蛋白质效应大小没有很强的相关性（r=0.37）（上图3e）。

此外，AD诊断面板显示出很高的准确性，与发现阶段观察到的结果相似(AUCcustom panels MCI(Aβ+)或AD与对照组相比分别为0.96和0.99; AUC custom panels MCI(Aβ+)或AD与非AD痴呆症相比分别为0.78和0.79)。

总之，这些发现表明AD诊断组可用于高准确度区分MCI(Aβ+)和AD与对照。           

主要结论

这项研究提供了对AD发病机制背后的多种和特定蛋白质变化的见解，并将多因素发现转化为可行的CSF生物标志物组。

这项研究主要得出以下结论：

• 1）CSF蛋白质在AD不同阶段有不同特征，反映了疾病不同阶段的不同生物过程和AD发病涉及到的分子机制；

• 2）基于这些差异蛋白，研究者开发并外部验证了一个由7种CSF蛋白组成的诊断面板，可将MCI(Aβ+)和AD患者与认知未受损的对照组和一组非AD痴呆患者做出准确区分。

综上所述，这项研究为 CSF蛋白质和相关生物过程提供了新的见解，也为AD病因学和机制研究提供了新的潜在线索，促进了生物标志物从发现到临床诊断工具的转化。

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