微生物实验室里的灭菌法你都知道吗？

目前，常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如，干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。

1.无菌操作室灭菌

培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的灭菌是至关重要的。由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌，熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]进行无菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30min，进行空气灭菌。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%-75%酒精擦拭。

2.培养液灭菌

培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，或在24小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。

使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.35~0.4 kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0~1.1 kg/cm2为121℃，保持15~20min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。在121℃的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在1.0-1.1 kg/cm2、121℃。

消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法消毒灭菌。首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置在无菌场所，固体培养液在40℃左右琼脂即将凝结前，加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。

液体培养液在冷却到室温后再加入过滤除菌溶液。过滤除菌时，使用孔径为0.22-0.45μm或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应进行高压消毒灭菌，温度不应超过121℃。

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械灭菌

玻璃器皿可进行干热灭菌或高压蒸汽灭菌，但在蒸汽灭菌后最好及时烘干水分。对不能进行高压蒸汽灭菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在无菌操作台面上晾干的同时，用紫外线重复杀菌。实验室还可以用环氧乙烷灭菌袋对塑料器皿进行消毒，消毒后的器皿要充分散气2-4小时后才可使用。无菌操作所用的各种器械，一般采用干热或高压蒸汽灭菌，或用75%酒精浸泡，然后在无菌操作台面上晾干的同时再用紫外线重复杀菌;在使用期间可多次对其进行酒精灯火焰灼烧灭菌。

4.培养材料的消毒灭菌

采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢(10~12%，浸泡5~15 min)、过氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。

1、撰写验证方案及制定评估标准。

2、确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行。

3、确认关键设备控制仪表在规定的参数范围内能正常运行。

4、采用被灭菌物品或模拟物品进行重复实验确认灭菌效果符合规定。

5、完善文件记录，撰写验证报告。

1、灭菌效果与灭菌前产品污染程度及污染菌特性有关，把握微生物污染水平及污染菌耐受性，注意各个环节降低污染程度。

2、灭菌冷却阶段防止已灭菌物品再次污染。

3、适用生物指示剂、化学指示剂等监控灭菌结果

生物指示剂

基本要求：

1、菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。

2、菌种应无致病性。

3、菌株应稳定，存活期长，易于保存。

4、易于培养。若使用休眠孢子，孢子含量在90%以上。

常用生物指示剂

1、湿热灭菌：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（ATCC7953等，活孢子数为5×105-5×106个/片)

2、干热灭菌：枯草芽孢杆菌孢子（ATCC9372等，活孢子数为5×105-5×106个/片)

3、辐射灭菌：短小芽孢杆菌孢子（ATCC27142等，活孢子数为5×107-5×108个/片)

4、气体灭菌：

（1）环氧乙烷灭菌：枯草芽孢杆菌孢子（ATCC9372等，活孢子数为5×105-5×106个/片)

（2）气态过氧化氢灭菌：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（ATCC7953等，活孢子数为1×106-5×106个/片)

（3）过滤除菌法：缺陷假单胞菌（ATCC19146等）。