质谱快速鉴定两例AIDS合并真菌性血流感染病例分析

获得性免疫缺陷综合征( AIDS)是由人免疫缺陷 病毒(HIV)引起的严重危害人类健康的传染病,以损伤免疫系统为主要特征,患者极易获得机会性感染, 而新型隐球菌、马尔尼菲蓝状菌等深部真菌的机会性 感染是AIDS患者死亡的主要原因之一[ 1]。新型隐球 菌最常引起的感染为隐球菌性脑膜炎,其发病隐匿、 病死率高。患者主要表现为难以忍受的头痛,伴发 热、恶心、呕吐,脑膜刺激征阳性等脑膜炎的症状与体 征[ 2]。隐球菌性脑膜炎在健康人群中很少发生,但在 AIDS患者中发病率较高。马尔尼菲蓝状菌是一种条 件性高致病性真菌,同时也是青霉菌属中唯一的双向 真菌,主要侵袭免疫低下的人群,尤其是AIDS患者。 其临床表现复杂多样且缺乏特异性,有文献报道, 85%的马尔尼菲蓝状菌感染发生于AIDS患者,已成 为AIDS临床诊断的指征性症状之一[ 3]。 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)是一种新型软电离生物质谱技术,通过检 测每种病原菌特征性的蛋白指纹图谱,并与数据库中 的图谱 库 进 行 比 对 即 可 鉴 定 出 待 测 病 原 菌。将 MALDI -TOF MS联合分离胶促凝管直接检测血培 养阳性瓶中的病原菌,可以极大地缩短检测时间[ 4], 为临床提供可靠的诊断依据。 本文通过回顾分析2例明确诊断的合并真菌感 染的AIDS病例,探讨质谱鉴定对AIDS患者合并真 菌感染诊断的临床价值。

1 病例资料

1. 1 一般资料 2018年9月常州市第一人民医院呼 吸科及血液科收治的2例合并真菌感染的 HIV患 者。病例1,男, 56岁,因“咳嗽伴乏力、纳差半月余” 入院。患者入院前1月无诱因出现阵发性咳嗽, 1周 前至当地医院就诊查胸片提示支气管炎,予“顺尔宁、 苏黄止咳胶囊”,症状无改善,后出现乏力、纳差进行 性加重。2 d前进食后呕吐少许胃内容物,于本院门 诊就诊并行相关检查。患者自述自起病来进食逐步 减少,体质量减轻约5 kg。患者神志清,精神萎,慢性 病面容。胸部CT示右肺下叶多发空腔性病变,多发 肺大疱伴感染,右肺下叶外基底段结节,右肺上叶后 段少许炎症,左肺多发纤维灶。病程中患者出现一次 发作性双眼上翻,持续数秒后好转;嗜睡,呼之睁眼, 颈部稍有抵抗。诊断为:肺部阴影:真菌感染可能;脑 炎(真菌性可能)。病例2,女, 39岁,因“发现锁骨上 淋巴结肿大2周余”入院。患者2周前无明显诱因发 现左侧锁骨上淋巴结酸痛肿大,伴有咳嗽、咳痰、发 热,并感全身乏力、头晕不适。患者病程中有晕厥1 次,约15 s后意识恢复。患者体温39 ℃,神志清,精 神萎。正电子发射计算机断层显像示多发淋巴结氟 代脱氧葡萄糖代谢增高,考虑淋巴瘤浸润;左上肺磨玻璃影结节氟代脱氧葡萄糖代谢增高;两肺局部轻度 炎症,右中肺微小结节。诊断为:淋巴结肿大待查、肺 部感染。

1. 2 MALDI -TOF MS鉴定 抽取5 mL阳性血培 养液注入分离胶促凝管,需氧瓶抽取的血培养液以 4 000 r /mi n离心10 mi n,厌氧瓶中抽取的培养液经 3 500 r /mi n离心7 mi n,分离待测病原菌。弃去分离 胶促凝管内上层液体,缓慢注入1 mL无菌蒸馏水将 待测菌沉淀混悬(不破坏促凝胶),将混悬液转移至无 菌1. 5 mL小 型 离 心 管 中,经13 000 r /mi n离 心 1 mi n。弃去上清液后重复洗涤一次,最后将离心后 管底的细菌混悬于1 mL无菌蒸馏水中待检。取 300 μL待测菌重悬液与900 μL无水乙醇混合,经13000 r /mi n离心1 mi n后弃去上清液,再经多次离心 以完全去除残留的无水乙醇,放置于空气中自然干 燥。加入70%甲酸30 μL使待测菌充分混匀,再加入 乙腈30 μL旋涡混匀,经13 000 r /mi n离心2 mi n,取 上清液用于 MALDI -TOF MS鉴定。取制备好的上 清液1 μL涂布于96孔金属靶板,室温干燥后在金属 靶板表面加入基质液α -氰4 -羟基肉桂酸1 μL,再次 室温干燥后进行检测。参数设置:线性,正离子,蛋白 峰谱m/z范围2~20 ×10 3,激光解析每孔100次。 应用B i o t ype r 3. 0统 进 行 数 据 库 比 对,得 出 鉴 定 结果。

1. 3 API 20 C板条鉴定 抽取血培养瓶中的培养液 进行纯培养,将分离到的菌落用无菌生理盐水配制成 2个麦氏单位待测菌悬液,取100 μL悬液至API CMed i um培养基中,混匀后加入鉴定板条, 28 ℃培养 72 h后进行结果判读。

1. 4 真菌小培养 将马铃薯葡萄糖琼脂培养基切割 成小块置于载玻片上,用接种环挑取纯培养的丝状真 菌接种于培养基的四角,盖上盖玻片, 28 ℃培养2~ 3 d后用乳酸棉兰酚染色,于高倍镜下观察真菌形态。

注: A表示血培养直接涂片革兰染色镜检结果( 10×100); B表示 35 ℃孵育48 h菌落形态; C表示28 ℃孵育48 h菌落形态; D表示真菌 小培养乳酸棉兰酚染色镜检结果( 10×40)。 图3 病例2血培养阳性涂片结果及纯培养菌落 特点与镜下结果

2 结 果

2. 1 质谱鉴定结果 2例患者均在入院后送检血培 养,在血培养报阳后直接用质谱仪进行检测。病例1 鉴定结果为新型隐球菌,质谱评分为2. 142。病例2 鉴定结果为青霉菌属某些种,质谱评分为1. 474。见 图1。

2. 2 传统鉴定结果 病例1:患者血培养双侧需氧瓶 分别于67、 70 h报警阳性,涂片革兰染色镜检找到正 圆形的芽生孢子。将标本接种在血琼脂平板、巧克力 琼脂平板及沙保弱培养基上, 35 ℃ 48 h培养均长出 白色光滑酵母样菌落。经API 20 C板条鉴定为新型 隐球菌。见图2。病例2:患者血培养双侧需氧瓶分别于77、 89 h 报警阳性,涂片革兰染色找到丰富的菌 丝及少量真菌孢子,孢子两头钝圆、中间有隔的腊肠 形。将标本接种在血琼脂平板、巧克力琼脂平板及沙 保弱培养基上,分别于28 ℃和35 ℃孵育48 h,血平 板上可见灰白色腊样、膜状平坦菌落,菌落中央可见 脐状凹陷; 35 ℃培养的沙保弱斜面上可见白色酵母 样菌落,不产生红色色素。28 ℃培养的沙保弱斜面上 可见淡红色绒毛状菌落,整个培养基被染成玫瑰红 色。真菌小培养后可见分枝分隔菌丝,分生孢子梗光 滑,呈帚状枝分散,多为对称双轮生;梗基上有3~6 个瓶梗,顶端变窄。通过培养的双相性以及帚状枝形 态可鉴定为马尔尼菲蓝状菌。见图2、 3。

2. 3 最终诊断结果 病例1患者经神经内科会诊后 考虑脑血管意外及 HIV脑病,经市传染病医院会诊 后考虑AIDS,中枢神经系统感染,隐球菌脑炎。予甘 露醇脱水,伏立康唑静滴抗真菌及纠正电解质紊乱等 治疗,并转至市传染病医院进行进一步治疗,目前患 者情况稳定,恢复良好。病例2患者淋巴结活检示锁 骨上淋巴组织增生,中性粒细胞灶性浸润,小脓肿形 成伴多量组织细胞反应,倾向感染性变化。请市传染 病医院会诊考虑AIDS,并转至市传染病医院进行进 一步治疗。

注: A表示血培养直接涂片革兰染色镜检结果( 10×100); B表示 35 ℃孵育48 h菌落形态; C表示28 ℃孵育48 h菌落形态; D表示真菌 小培养乳酸棉兰酚染色镜检结果( 10×40)。 图3 病例2血培养阳性涂片结果及纯培养菌落 特点与镜下结果

3 讨 论

真菌性血流感染是AIDS患者较为常见的机会性 感染,谢朝云等[ 5]报道艾滋病合并真菌感染发病率为 36. 61%。新型隐球菌和马尔尼菲蓝状菌是AIDS常 见的机会致病真菌,有文献报道AIDS患者合并隐球 菌脑膜炎的一年归因死亡率为24. 2%[ 6],合并感染马 尔尼菲蓝状菌的病死率可达18%~26%[ 7],因此及时 的病原学诊断是关键。隐球菌性脑膜炎患者多表现 为发热、头痛及呕吐等中枢神经症状,病例1中的患 者在病程中出现嗜睡、颈部稍有抵抗等隐球菌性脑膜 炎相关症状,与最终鉴定结果完全相符合。马尔尼菲 蓝状菌感染后,临床表现为发热、肝脾肿大、淋巴结肿 大、呼吸和消化系统异常等症状,病例2中的患者经 淋巴结活检提示淋巴结脓肿,排除了淋巴瘤的可能, 其症状与马尔尼菲蓝状菌感染相符。 回顾2例患者的诊断过程,病例1中的患者怀疑 感染,病例2中的患者病情较为复杂,高热且主诉淋 巴结肿大,对于这两类临床上暂时无法确诊的患者, 首先应采集血液、脑脊液、骨髓等标本进行涂片与培 养,尽可能地查找病原学依据[ 8],及时的病原学诊断 对成功治疗深部真菌感染起到极大的作用[ 8]。传统 真菌鉴定的方法虽然较为准确,但其耗时长,对检验 者经验要求高,极易造成误诊及漏诊。质谱仪的使用 极大地缩短了检测时间,将分离胶促凝管联合质谱仪 可以直接检测血培养阳性的病原菌,缩短了转种培养 鉴定的时间。隐球菌的传统鉴定主要依赖API板条, 需要72 h才能判读结果,而墨汁染色虽较为便捷,但 由于隐球菌荚膜厚薄不定,结果观察受检验者经验影 响较大[ 9]。传统方法鉴定马尔尼菲蓝状菌需要4~10 d[ 7],采用质谱快速鉴定的方法当天即可给出该真 菌属的初步鉴定结果,且检测结果与传统真菌培养的 结果相符合,极大地减少了花费在真菌鉴定上的时间 成本[ 10 11]。虽然对青霉菌只能鉴定到属的水平,仍需 结合经典的真菌培养及形态学观察才能鉴定到种的 水平,但这无疑可以为临床诊疗争取到更多的时间。 此外,相较于传统真菌鉴定方法,使用质谱仪直接鉴 定血培养阳性瓶中的真菌操作更加简单,且易于制定 标准化操作流程,从而可以减少人为因素造成的鉴定 误差。 综上所述, AIDS患者易合并条件致病性真菌的 感染,真菌感染的诊断依赖病原学鉴定。传统形态学 鉴定对于真菌感染的诊断有重要意义,但其耗时较 长,而质谱技术的出现简化了操作流程,缩短了鉴定 时间,为临床真菌感染的治疗赢得了时间。提高对不 明原因发热或感染患者的血培养送检率,尽早查找病 原菌并及时对症治疗,结合新兴的质谱技术缩短病原 菌检测时间,为临床诊断提供更加及时可靠的依据。

参考文献略。

原始出处：

丁 宁,王玉月等，质谱快速鉴定两例AIDS合并真菌性血流感染病例分析[J],国际检验医学杂志，2020,41（3）。