先天性心脏病相关肺动脉高压儿童患者的呼吸道微生物组特征

先天性心脏病相关的小儿肺动脉高压患者的呼吸道微生物组特征

研究背景

肺动脉高压（PH）是一种由多种病因引起的临床综合征，具有肺动脉阻力增加和血管重塑的类似病理特征。通过心导管检查，儿童静止时肺动脉平均压力>20mmHg，成人也是如此。先天性心脏病包括许多种心血管系统的先天性异常，对气道和肺实质功能有重大影响，使患者容易出现肺部并发症。据估计，有10%的CHD患儿最终会发展成PH，在大多数情况下是左至右分流的结果，其5年生存率约为71%。先天性心脏病（CHD）相关的肺动脉高压（PH）是小儿患者中最常见的PH类型。对CHD-PH患者的气道微生物组的研究仍然很少。

研究方法

本研究共招募了158名儿童，收集口咽拭子，对呼吸道微生物组的16S核糖体RNA（16S rRNA）V3-V4区进行测序，以建立这些细菌组与CHD-PH患者超声心动图指标之间的相关性。根据纳入和排除标准，收集了54名CHD患者、69名CHD-PH患者和35名健康人的口咽拭子样本。 如表1所示，CHD组、CHD-PH组和对照组在性别和分娩方式上没有明显差异。CHD和CHD-PH患者的年龄和诊断有差异。研究结果

对使用微生物DNA生成的16S rRNA扩增子文库进行测序，共得到804万条高质量的序列，每个样品平均有49955±17190条序列。 如图1A和1B所示，与对照组相比，CHD的群落分化程度没有明显差异。 Ace、Chao和Sobs指数显示，与CHD患者和对照组相比，CHD-PH患者的群落丰富度明显下降。 同时，CHD-PH组的Shannon指数明显降低，Simpson指数增加，这共同表明群落均匀度下降，显示出α-多样性的强烈下降（图1B）。 CHD-PH组的Invsimpson指数略有下降，但没有意义。为了分析β-多样性，我们进行了主坐标分析和偏最小二乘法判别分析。基于Bray-Curtis异质性的主坐标分析显示，CHD组、CHD-PH组和对照组的气道微生物组组成的总体系统发育距离有明显差异（图1C，PERMANOVA，P<0.05）。同样，偏最小二乘法判别分析也显示了3个组的微生物组的不同情况（图1D）。总的来说，3组的细菌群结构有明显的不同，样品可以根据类别进行分组。气道微生物组的细菌α-和β-多样性表明，CHD-PH组的丰富度明显较低，其组成差异与上呼吸道的特定分类群及其相对丰度有关。

在CHD-PH组中，系统水平的分析显示， Firmicutes是最丰富的系统，其次是Actinobacteriota、Bacteroidta、Proteobacteria、Fuso-bacteria和Patescibacteria（图2A）。图2B中显示了丰度最丰富的6个门类。与CHD组和对照组相比，Patescibacteria和Fusobacteria在CHD-PH组的比例明显下降（图2B）。在科一级，CHD-PH患者的特点是Veillonellaceae和Actinomycetaceae的相对丰度较低，而Micrococcaceae的相对丰度较高（图2C，2D）。图2E显示了属一级的微生物群组成。链球菌和罗氏菌的比例在统计学上较大，而Veillonella和放线菌在CHD-PH组的比例在统计学上小于对照组（图2F）。

CHD-PH中特定的上呼吸道微生物群在CHD组和对照组之间有差异。分别对3组细菌组成的差异进行了比较和分析显示了CHD-PH与对照组（图3A和3B）、CHD与对照组以及3组之间在门类和属的水平上丰富程度不同的微生物群。同样，CHD和CHD-PH患者中的链球菌和Veillonella的比例也与对照组的不同。通过线性判别分析效应大小算法，分析了CHD-PH组和对照组之间上呼吸道微生物群的最大差异，确定链球菌和Rothia在CHD-PH患者中含量最丰富（图3C）。根据线性判别分析效应大小确定的相关属建立了一个OUT子集，通过接收器操作特征曲线分析评估，显示参数曲线下的面积为0.77（图3D）。当与CHD患者相比，那些PH患者也显示出不同的微生物群的相对差异。在门类水平上，CHD-PH显示出蛋白细菌、镰刀菌属、门齿菌属和蓝藻属的减少（图3E）。在属的层面上，PH中放线菌、嗜血杆菌、颗粒菌、Leptotrichia、Gemella、Rhodococcus、Alloprevotella和TM7x的比例明显减少（图3F），而Rothia和Neisseria在CHD-PH中明显富集（图3G）。基于CHD与CHD-PH中富集属的接收操作特征曲线分析显示，参数曲线下的面积值为0.71（图3H）。

儿童和成人PH患者之间的微生物组成比较。儿童CHD-PH患者的上呼吸道微生物组与成人PH患者的微生物组的比较也表明，在健康人和PH患者中，儿童和成人的微生物群完全不同。在门类层面上，与成人相比，儿童PH患者的 Firmicutes和Actinobacteriota表现出明显的增加（图4A），而链球菌属在儿童患者中的含量远远高于成人（图S3）。与相应的对照组相比，在儿童和成人PH患者中，类杆菌属、放线菌属、镰刀菌属和扇贝菌属都有类似的下降趋势。主坐标分析和部分最小二乘法判别分析显示PH患儿的微生物群与成人的微生物群有明显的分离（图4B和4C）。此外，在属的层面上，微生物结构显示出巨大的差异，儿童CHD-PH患者中链球菌和罗氏菌的比例更高。Prevotella, Neisseria, Haemophilus, Fusobac-terium, Granulicatella, Leptotrichia, Porphyromonas, Allo-prevotella, TM7x, and Capnocytophaga在成人PH组相对普遍（图4D）。

CHD相关PH的细菌丰度和TTE指数的相关性。对CHD-PH患者的上呼吸道微生物组分类群和TTE指标进行了Pearson相关分析，以确定更深层次的分类群关联。对于整个CHD-PH患者（图5A），链球菌属与主肺动脉（Pearson相关系数R=-0.33）、右心室（R=-0.38）和右心室流出道（R=-0.33）呈负相关，这些是代表右心功能。 相反，多种细菌与右心功能呈正相关。Megasphaera和TTE指数之间存在正相关，包括主肺动脉（R=0.51）、右静脉流出道（R=0.34）和三尖瓣面积（R=0.35）。发现右心室与Prevotella（R=0.43）和Alloprevotella（R=0.41）呈正相关。TM7x、Atopobium、Leptotrichia和Firmicutes中的一些母类群也与右心功能轻度相关。

度ph（55≤pasp<75mmhg，n=30）和重度ph（pasp≥75mmhg，n=15），检测ph分层的微生物群与tte指标的相关性。图s4显示了ph严重程度各组的微生物群组成。 r="0.63）、Leptotrichia（R=0.59）、Alloprevotella（R=0.79）、Lachnoanaerobacu-lum（R=0.71）和TM7x（R=0.62）呈正相关（图5C）。在重度PH组（图5D），我们观察到主肺动脉与Selenomonas（R=0.73）、Megasphaera（R=0.74）、Leptotrichia（R=0.65）和Veillonella（R=0.59）正相关，右心室流出道和肺动脉预压分别与Gemella（R=0.54）和Neisseria（R=0.54）正相关。这些结果表明，不同类别的微生物可能与不同的PH严重程度有关。
</pasp<55mmhg，n=24）、中度ph（55≤pasp<75mmhg，n=30）和重度ph（pasp≥75mmhg，n=15），检测ph分层的微生物群与tte指标的相关性。图s4显示了ph严重程度各组的微生物群组成。>

儿童CHD-PH患者与对照组之间的微生物功能不同。在分析气道微生物组的丰度组成的基础上，通过重建未观察到的状态的社区的系统发育调查（PICRUSt2）预测CHD-PH与对照组的微生物组的功能。由图5E可见，PH组的几个物质代谢途径，包括半乳糖、氨基糖和核苷酸糖、代谢、肽聚糖、苯丙氨酸、酪氨酸和精氨酸生物合成，都明显高于对照组，而CHD-PH组的微生物代谢、脂多糖、乙醛酸和二羧基酸、组氨酸、氮和抗坏血酸代谢途径则明显低于对照组。

研究结论及启示

总之，该研究报道了儿童PH患者、CHD和对照组以及儿童和成人PH患者之间上呼吸道微生物群的系统定义和不同的情况。CHD-PH的上气道微生物群组成与健康人和小儿CHD患者的不同。研究结果全面地证明了儿童CHD-PH患者上气道细菌种群的变化与TTE参数所反映的心血管结构之间存在潜在的相关性。有必要进行前瞻性研究，以探讨这种微生物群的破坏是否会增加小儿CHD患者发生PH的风险。