Nature Biotechnology：诺奖得主Jennifer Doudna开发新型RNA调控工具CRISPR-Csm，效率更高、脱靶性更低

在过去20年里，我们可以通过RNA干扰（RNAi）技术实现对真核生物的RNA进行靶向敲低（Knock Down），该技术于2006年获得了诺贝尔生理学或医学奖。但RNAi也存在一些不足之处，例如，RNAi可能导致携带部分序列互补性的靶标的意外切割；RNAi主要在细胞质发挥作用，因此对细胞核RNA的靶向效率低下；RNAi还与某些真核生物系统不相容。因此，开发具有更高特异性和更广泛靶向能力的新型RNA调控工具很有必要。

最近10年里，CRISPR-Cas9基因编辑技术让我们能够高效且精准的靶向编辑DNA，但这种方式带来的DNA双链断裂可能会导致一系列潜在风险，这也限制了其在临床上的应用。而对细胞和生物体的RNA和蛋白质进行修改或调控，能够避免对DNA造成永久性改变，这对基础研究和疾病治疗都非常重要。

CRISPR-Cas系统是细菌和古菌的防御系统，其中Cas作为可编程的DNA或RNA核酸酶发挥作用。与RNAi类似，Cas核酸酶使用crRNA通过碱基配对互补来识别核酸靶标。其中，Cas13能够对真核生物的RNA进行切割，已被开发用于RNA病毒检测工具（例如SHERLOCK系统）。

然而，Cas13不仅会顺式切割靶标RNA，还会反式切割附近的非靶标RNA，这会造成细胞毒性和/或细胞死亡，因此，Cas13可能还不适合作为特异性RNA编辑工具。

2023年1月23日，诺贝尔奖得主 Jennifer Doudna 教授团队在 Nature 子刊 Nature Biotechnology 发表了题为：Precise transcript targeting by CRISPR-Csm complexes 的研究论文，该论文于2022年6月提前在预印本平台bioRxiv上线。

该研究开发了基于CRISPR-Csm的新型RNA调控工具，可在人类细胞中高效敲低RNA，效率高达90%-99%，而且具有最低的脱靶效应，还可以作为活细胞RNA成像工具。这项研究也证实了多亚基CRISPR-Cas系统可作为真核生物RNA靶向工具的可行性和有效性。

VI型CRISPR-Cas13可以在crRNA的引导下切割靶标RNA（顺式切割）。但是，它还可以随机切割附近的其他单链RNA（反式切割），这种非特异性切割活性已被应用于核酸检测，例如张锋团队开发的SHERLOCK系统。但将Cas13应用于疾病治疗时，这种不受控的随机切割活性，就成了致命缺陷。

Cas13的顺式切割和反式切割

2022年8月，杨辉团队在 Nature Biotechnology 期刊发表论文，开发了一种高保真Cas13突变体——hfCas13d，既表现出对靶标RNA的高效降解能力，又显着降低了随机切割活性，这为CRISPR-Cas13系统的安全应用打开了新的大门。

详情：专访杨辉：新型Cas13，解决临床应用障碍，让体内RNA编辑和治疗更具竞争力

而 Jennifer Doudna 则把目光放到了其他CRISPR系统上——CRISPR-Csm。CRISPR-Csm是一类III型CRISPR系统，Csm由5个不同亚基组成（Csm1-5），并依赖于额外的Csm6来处理前体crRNA，这种多亚基Cas虽然广泛存在，但相比Cas9这些单亚基Cas，多亚基Cas成分复杂，因此极少被应用。

但是，Csm不会像Cas13那样出现反式切割，而且可以进入细胞核，因此能够解决RNAi无法靶向细胞核RNA的问题。因此，Csm具有开发为一种精确且广泛的RNA编辑工具。

在这项研究中，Jennifer Doudna 团队选择了来自嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的Csm酶，并进行了人类密码子优化、添加细胞核定位信号，将其用于人类细胞的RNA编辑。

研究团队通过单载体递送的CRISPR-Csm系统，对人类细胞中的11个RNA进行编辑（包括3个细胞核非编码RNA和8个细胞质mRNA），结果显示，Csm实现了对全部11个RNA的高效RNA敲低效果（90%-99%）。

左侧三个为定位于细胞核的非编码RNA，右侧8个为定位于细胞质的mRNA

研究团队还将Csm与Cas13和RNAi（shRNA）这些已有的RNA敲低工具进行了：Cas13能够有效敲低靶标RNA，但也会影响数百个非靶标RNA水平；而shRNA对靶标RNA的敲低效果取决于该RNA定位于细胞核还是细胞质，同时也会影响少量非靶标RNA水平。而Csm介导的RNA敲低，在人类细胞中显示出最小的脱靶效应。

此外，研究团队还发现，Cas13编辑的细胞表现出明显地增殖/活力下降，而Csm或shRNA则几乎不影响细胞增殖/活力。这些结果表明，相比Cas13，Csm介导的RNA敲低对细胞的毒性更小。

最后，研究团队还将催化活性丧失的Csm与绿色荧光蛋白（GFP）融合，实现了对或细胞中特定RNA的成像和追踪。

总的来说，这项研究表明，相比Cas13，Csm不具有反式切割活性，更精准和安全；相比RNAi，Csm可以定位于细胞核，可靶向细胞核非编码RNA及Pre-mRNA。因此，Csm可作为一种高效、特异型和通用的真核生物RNA敲低工具。此外，催化活性丧失的Csm还能实现特异性和持久的RNA结合，可用于活细胞RNA成像。

原始出处：

Colognori， D.， Trinidad， M. & Doudna， J.A. Precise transcript targeting by CRISPR-Csm complexes. Nat Biotechnol (2023). https：//doi.org/10.1038/s41587-022-01649-9.