读书报告 | 单细胞RNA测序评估新辅助免疫化疗治疗对NSCLC免疫微环境的重塑作用

导读

抗PD-(L)1免疫检查点抑制治疗已成为晚期NSCLC的一线治疗方案。而对于早期可切除的NSCLC，新辅助免疫治疗已经显示出良好的应用前景。然而，新辅助免疫疗法在早期NSCLC的平均主要病理缓解率（MPR）约为32%，大多数患者系ICB难治性或获得耐药，其潜在机制仍有待探索。肿瘤微环境（TME）对于肿瘤治疗耐药具有关键作用，而免疫疗法本身又可重塑TME（克服T细胞功能障碍/衰竭，促进T细胞克隆扩增），两者相辅相成、互为表里。因此，更全面地表征NSCLC患者在ICB治疗期间的TME有利于更加准确地预测患者反应，并可能进一步提供新的治疗靶点。

本文利用单细胞测序、转录组测序、非靶向代谢组学以及多色荧光染色系统描述了可切除的NSCLC患者接受新辅助免疫治疗过程中TME的动态变化，观察到MPR者抗原递呈机制活化、FCRL4+FCRL5+记忆性B细胞和CD16+CX3CR1+单核细胞激活。而NMPR者雌激素代谢酶过表达和血清雌激素升高，为后续临床实践提供思路和依据（Genome Med. 2023 Mar 3;15(1):14. doi: 10.1186/ s13073-023-01164-9）。

研究背景

ICB是无驱动基因突变的晚期NSCLC患者的一线治疗方案，而对于早期可切除NSCLC，新辅助免疫治疗显示出良好的应用前景

然而，新辅助免疫疗法在早期NSCLC的平均主要病理缓解（MPR）率约为32%，可见大多数患者为难治性或获得耐药，其潜在机制仍有待探索

免疫疗法重塑TME（克服T细胞功能障碍/衰竭，促进T细胞克隆扩增），而TME反过来影响对免疫疗法的应答（T细胞克隆扩增的患者对ICB治疗反应良好）

因此，更全面地表征NSCLC患者ICB治疗期间的TME有利于更准确地预测患者反应，并可能提供新的治疗靶点

患者队列

无EGFR/ALK突变的可切除NSCLC患者

先接受2～4个周期（3周/cycles）新辅助治疗（PD-1抗体+基于铂类的化疗），然后接受手术

2019年9月~2021年5月共招募39名患者，包括scRNA-seq队列（n=15）、独立RNA-seq队列（n=21）和另外3名仅捐献外周血的患者。

研究样本

给药前通过经皮肺活检、支气管镜活检或支气管内超声活检获得原发部位肿瘤组织，最后一程新辅助治疗后立即手术切除肿瘤组织；15例患者中选择了15个肿瘤样本进行scRNA-seq，21名患者中选取了21个治疗前肿瘤样本进行RNA-seq

在3个时间点收集了24例患者的67个外周血样本：基线（n= 24）、治疗中（第1/第2个周期，n= 24）和治疗后（最后一个周期后，n= 19）；24例患者中，9例来自scRNA-seq队列，12例来自独立RNA-seq队列

PD1抗体联合化疗期间NSCLC患者的scRNA-seq表征治疗后TME重塑

B：使用92330个细胞的转录组进行分析，中位基因数为1256个/细胞，确定了26个群。

C/D：TN、MPR和NMPR患者中不同细胞类型的比例

• MPR患者中，T细胞、NK细胞和B细胞的比例增加，尽管由于样本量有限而没有得到阳性P值。

• 髓系细胞在TME中富集，但在TN、MPR和NMPR患者中没有表现出差异。

E/F：IHC染色证实，在MPR样本中，除NK细胞（CD56⁺）外，T细胞和B细胞丰度增加。

这与之前的报道一致，即T细胞和B细胞扩增与ICB更好的应答有关。

联合治疗后达pCR的患者：正常肺上皮细胞增加并检测到残留肿瘤细胞

将上皮细胞重新聚类为10个群，然后分离恶性细胞和正常细胞。

肺泡细胞（E5_SFTPA2）、分泌细胞（E8_SCGB1A1）和纤毛细胞（E9_TPPP3）的组分在治疗后增加，尤其是MPR的患者，表明联合治疗在消除恶性细胞后，促进正常上皮细胞扩增（可能有助于重建先前肿瘤床中的正常肺结构）。

恶性细胞不同的分子特征区分MPR和NMPR

C: MPR患者的恶性细胞高表达CX3CL1（-CX3CR1, NK/单细胞）、CD74（肿瘤抗原）和MHC-II；TCGA队列中，CD74和HLA-DRA高表达与更好的预后相关

D：NMPR患者的癌细胞高表达AKR1B1/10（促转移/耐药）和AKR1C1-3（参与雌激素代谢，催化雌激素还原为β-雌二醇）

E：NMPR患者的恶性细胞中雌激素反应途径上调 

F/G：检测基线、治疗中和治疗后血清类固醇的丰度：10名MPR和14名NMPR；与基线相比，NMPR患者的β-雌二醇（可能产生免疫抑制性TME）水平显著升高。

联合治疗后细胞毒性T/NK细胞扩增及Tregs减少的程度与病理应答呈正相关

A/B：14个T/NK细胞群

C/D：治疗后，CD8⁺T/NK的细胞毒性和耗竭信号均显著增加 

E：治疗后所有CD8⁺T细胞群组分增加；与TN相比，治疗后MPR患者Tem（CD8_GZMK，驻留在TME，ICB后局部扩增）和Trm（CD8-GZMB，其增加与新抗原特异性T细胞的扩增一致）以及循环效应T细胞（CD8_STMN1）的占比增加得更明显

E：幼稚Tregs（Treg_SELL）在MPR和NMPR患者中均降低，而活化Tregs（Treg_CTLA4）仅在MPR患者中降低

FCRL4+FCRL5+记忆B细胞预测对ICB的反应，并通过激活CD4⁺T细胞促进免疫治疗

MPR患者中，高表达CD86的FCRL4+FCRL5+（预后更好）非典型记忆B细胞表现出增加趋势

D：多色荧光染色显示这群细胞在MPR中富集程度更高；CD20⁺B细胞在TLS中聚集,  FCRL4+FCRL5+B细胞位于TLS的中心（与抗肿瘤活性和对联合治疗的积极响应有关）。

E/F/G：在另外两个黑色素瘤队列中，应答者（CR/PR）的B4_FCRL4信号高于无应答者（SD/PD）。

H：细胞互作分析发现这群B细胞可以通过CD86-CD28和CD40-CDLG激活滤泡辅助T细胞（Tfh）产生IL-21，而IL-21可进一步激活CD8⁺T细胞。

CX3CL1募集巡逻单核细胞预测免疫治疗反应

A：髓系细胞分为2个单核细胞亚型、6个巨噬细胞亚型和3个DC亚型

B/C/D：Mono_CX3CR1代表“幼稚样”状态，Mono_VEGFA代表“前巨噬细胞”状态（幼稚单核和巨噬细胞之间的中间表型）

E/F/G：MPR患者中，Mono_VEGFA细胞减少，而Mono_CX3CR1细胞（与巡逻单核细胞相似）丰度增加，后者通过分泌CFP诱导TC凋亡

H/I/J：验证队列的MPR患者和两个独立黑色素瘤队列的应答者中，观察到更高水平的Mono_CX3CR1信号，且与生存率的提高有关

K：细胞相互作用分析表明，CX3CL1-CX3CR1配对在Mono_CX3CR1细胞和MPR患者的癌细胞之间显著富集。

联合治疗使组织驻留巨噬细胞扩增，并将TAM重新编程为M0表型，解除MPR患者的免疫抑制

A：Macro_FABP4（即AM，组织固有肺泡巨噬细胞，可与AT2细胞共同作用，再生正常肺结构）在治疗后患者中显著升高，在MPR患者中升高程度更显著

B：AM表现出M0样表型，Macro_SPP1、Macro_SELENOP和Macro_C1QA均具有更强的M2特征，只有Macro_CXCL9显示出高M1信号

C：在MPR患者中，M2信号降低，然而M1特征和M1样亚群也在治疗后减少；与TN患者相比，MPR患者的M0特征增加

DC被治疗激活并在MPR患者中扩增

E：mregDCs（通过IL-4与肿瘤浸润性Treg相互作用，或抑制CD8⁺T介导的抗肿瘤免疫）可能由cDC1s和cDC2s产生。

联合治疗后，MPR患者的cDC1s和cDC2s分数增加。

F：DC的抗原呈递特征在治疗后显著增加，尤其是MPR患者，表明DC在治疗后被激活。

D/G：DC_CD1C细胞表达CX3CR1，CX3CL1-CX3CR1相互作用在DC_CD1C细胞和MPR患者的癌细胞之间显著富集

DC在治疗后被激活，并在MPR患者中被募集，这可能有助于TME中CD8⁺和CD4⁺T细胞激活。

MPR患者的衰老中性粒细胞减少，并通过CCL3和CCL4募集SPP1+TAM

A/B：中性粒细胞分为4个亚群：2个成熟亚群和2个衰老亚群

C：Neu_S100A12亚群是轨迹的根源，Neu_CCL3亚群（衰老亚群，过度分泌多种趋化因子，其中CXCL8是免疫治疗不良结果的有力预测因子，并且高表达PD-L1和IDO1等及趋化因子IL8）是终点

E/F：MPR患者的Neu_CCL3细胞消耗最多，并且Neu_CCL3细胞的CXCL8表达较低

G/H/J：细胞互作分析发现CCL3+的衰老中心粒可能和SPP1+巨噬细胞存在着正反馈调节以互相促进增加：SPP1+巨噬细胞分泌SPP1诱导中性粒向衰老CCL3+表型转化，而这群中性粒则分泌CCL3、CCL4等趋化因子反过来招募更多的SPP1+巨噬细胞。

小结

ICB联合化疗期间NSCLC患者的TME动力学

共同特征：化免治疗后IC表型重塑，TME中的正常上皮细胞扩增。效应T细胞的细胞毒性作用显著增强；然而耗竭Marker也增加了。记忆性CD8⁺T细胞被激活为效应表型。治疗增强了DC的抗原呈递功能。

1）MPR中残留的TC表达MHC-II以呈递肿瘤抗原，并分泌CX3CL1以招募PMos（分泌CFP促进TC凋亡）、cDC2s和CD16⁺NK细胞。Tfhs释放CXCL13募集CD20⁺B细胞，使其聚集在TME中。来自cDC2s的IFNα和TNF驱动FCRL4⁺FCRL5⁺记忆B细胞产生，后者通过CD86-CD28和CD40-CD40LG相互作用激活Tfhs。活化的Tfhs分泌IL21来增强效应T释放GrB。MPR中抑制性Tregs和TAM的M2信号降低。

2）在NMPR患者中异常的雌激素代谢导致TME中的雌二醇升高。NMPR中的TME仍然具有抑制性，TAMs的M2信号没有减少，VEGFA⁺单核细胞和Tregs的抑制信号没有增加。而SPP1⁺TAMs和CCL3⁺中性粒细胞相互作用以促进扩增：SPP1⁺TAM分泌SPP1和IL1B以诱导CCL3⁺嗜中性粒细胞的产生，而CCL3⁺中性粒反过来通过CCL3/CCL4吸引SPP1⁺TAMs。