盘点：浅析诱导性多能干细胞安全性

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS细胞, 也缩写为iPSC）最初是日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）于2006年利用病毒载体将四个转录因子---Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc--导入到小鼠小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种干细胞类型，产生的iPS干细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。随后世界各地不同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种iPS细胞。 

2007年11月20日，美国威斯康星大学詹姆斯-汤姆森的研究小组在《科学》杂志发表利用慢病毒载体将Oct4、Sox2加Nanog和LIN28这种因子导入到人皮肤细胞中，而使得它们转变成iPS细胞，而日本京都大学教授山中申弥领导的研究小组也于同日在《细胞》杂志发表类似的研究结果：利用逆转录病毒将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子导入到人皮肤细胞中，而使得它们转变成iPS细胞。

相比于胚胎干细胞，iPS细胞不会产生伦理问题，而且利用宿主自身的成体细胞（如皮肤细胞、血细胞等）经重编程变成iPS细胞，将它们移植回相同个体，应该有可能不会引发免疫反应，此外iPS细胞非常适合用来构建疾病模型，不过将iPS细胞用于治疗时也有风险：让iPS细胞移植到体内时有可能会产生肿瘤。

近期几篇关于iPS细胞的研究涉及它们是否存在导致癌症的突变，比如研究人员采用三种流行的iPS细胞制造方法---整合性逆转录病毒载体，非整合性仙台病毒和人工合成mRNA---制造iPS细胞，发现它们没有产生显著的致癌性突变；另外，研究人员利用血细胞制造出iPS细胞，发现iPS细胞中产生的突变比用来制造它们的血细胞少10倍，而且在这些iPS细胞发生的基因突变中，没有一种突变存在于已知导致癌症的基因中。然而，也有研究人员认为不应当只考虑iPS细胞的细胞核基因组是否发生有害的突变，还应考虑它们的线粒体基因组是否也发生不好的突变，这是因为他们发现iPS细胞含有存在缺陷的线粒体DNA，而且这种线粒体DNA缺陷与用来制造iPS细胞的成体细胞年龄相关联。另外一项研究发现，iPS细胞质量除了与成体细胞年龄相关联外，还与成体细胞的来源位置相关联。

1. Cell Metab：科学家找到人类多能干细胞的“命门” 有助解决干细胞治疗成瘤问题

近日，国际学术期刊Cell Metabolism在线发表了日本庆应大学医学院的一项最新研究进展，他们发现人类多能干细胞（hPSC）在缺乏葡萄糖和谷氨酰胺的情况下无法生存，由于hPSC存在特殊的基因表达模式，因此无法有效利用丙酮酸。这项研究对于清除干细胞治疗过程中残存的未分化干细胞，防止肿瘤形成具有重要意义。

之前研究发现，人类多能干细胞依赖有氧糖酵解产生ATP，但是在ATP合成过程中氧化磷酸化的主要能量来源以及重要性并没有得到完全阐明。

在经过详细的氨基酸分析之后，研究人员发现谷氨酰胺对于hPSC的存活必不可少。在葡萄糖和谷氨酰胺匮乏的情况下，hPSC会因为缺少ATP而发生快速死亡。随后研究人员又进行了代谢组学分析，结果表明hPSC对丙酮酸的利用能力很差，谷氨酰胺是氧化磷酸化的主要能量来源。hPSC无法有效利用丙酮酸合成ATP的主要原因在于hPSC内顺乌头酸酶2（ACO2）和异柠檬酸脱氢酶2/3（IDH2/3）的表达水平非常低，几乎可忽略不计，而ATP-柠檬酸裂合酶的表达水平非常高，因此hPSC无法利用丙酮酸来源的柠檬酸。

除此之外，研究人员还发现虽然分化之后携带成熟线粒体的心肌细胞在没有葡萄糖和谷氨酰胺的情况下也无法存活，但它们能够使用乳酸用以产生丙酮酸和谷氨酸为细胞提供能量。（Cell Metabolism, doi:10.1016/j.cmet.2016.03.001 ）

2. Cell Stem Cell：线粒体DNA突变潜藏于人诱导性多能干细胞中

在一项新的研究中，美国俄勒冈健康与科学大学（OHSU）胚胎细胞与基因治疗中心主任Shoukhrat Mitalipov博士及其研究团队首次证实一个存在已久的假设：当变老时，基因突变积累在人们的线粒体（即细胞能量工厂）中。

研究人员发现作为一类对病人的皮肤细胞或血细胞进行重编程而产生的干细胞，诱导性多能干细胞（iPS细胞）含有存在缺陷的线粒体DNA。相关研究结果于2016年4月14日在线发表在Cell Stem Cell期刊上，论文标题为“Age-Related Accumulation of Somatic Mitochondrial DNA Mutations in Adult-Derived Human iPSCs”。论文通信作者为Shoukhrat Mitalipov和Taosheng Huang。

Mitalipov说，“人们长期以来认为我们的线粒体DNA中的致病性突变是衰老和年龄相关性疾病的一种驱动力，不过一直都缺乏明确的证据。如今，利用这项研究中的证据，我们知道我们必须筛选iPS细胞中发生的突变，或者在年龄更为年轻时收集人体细胞制造iPS细胞，从而确保它们的线粒体基因是健康的。这种对细胞在自然衰老过程中如何遭受损伤的基本了解可能有助消除发生基因突变的线粒体在退化性疾病中发挥的作用。”

基于干细胞的潜在疗法有巨大的希望用于治疗人类疾病。然而，线粒体缺陷可能能够破坏iPS细胞修复受损组织或器官的能力。为了避免损害iPS细胞的治疗价值，Mitalipov和同事们建议对这些细胞进行线粒体DNA突变筛选。（Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2016.02.005）

3. PLoS Genet：诱导性多能干细胞不会产生导致癌症的基因突变

在一项新的研究中，来自英国剑桥大学韦尔科姆基金会桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）等机构的研究人员利用血细胞制造出诱导性多能干细胞（iPS细胞），而且不会在这种干细胞中引入随后可能导致癌症产生的基因变化。相关研究结果于2016年4月7日发表在PLoS Genetics期刊上，论文标题为“Mutational History of a Human Cell Lineage from Somatic to Induced Pluripotent Stem Cells”。

这一发现对正在找出方法将iPS细胞用于再生医学的科学家们而言是一大鼓舞。iPS细胞是对健康的体细胞进行重编程而制造出的一种干细胞类型。 当人从胚胎长成小孩、成年人以及变老时，人体内的细胞产生许多微小的基因突变。大多数基因突变不会产生影响，但是一些突变能够导致癌症。研究人员追踪了这种捐献的血细胞和由它产生的iPS细胞的基因变化历程。

这些研究结果揭示出iPS细胞中产生的基因突变比他们在实验室培养的血细胞少了10倍，而且在这些iPS细胞发生的基因突变中，没有一种突变存在于已知导致癌症的基因中。（PLoS Genetics, doi:10.1371/journal.pgen.1005932）

4. PLos Genet：制造干细胞时需要考虑来源细胞的位置和年龄

在一项新的研究中，来自美国Lieber脑发育研究所（Lieber Institute for Brain Development, LIBD）的Andrew E. Jaffe博士及其研究小组研究了在个人化医疗领域持续获得关注的几种人细胞的分子差异，他们的研究结果于2016年2月25日发表在PLoS Genetics期刊上，论文标题为“Strong Components of Epigenetic Memory in Cultured Human Fibroblasts Related to Site of Origin and Donor Age”。这项研究提示着用于产生新组织和器官的人类细胞来源可能是进行个人化医疗时的一个重要的考虑因素。

在全世界，人们正在将大量的资金投资于个人化医疗，重点投入开发用于产生新组织和器官的干细胞系。专家们主要依赖皮肤样品作为他们的细胞来源，这是因为皮肤细胞能够在体外培养中生长，而且在实验室中也相对容易获取它们和将它们重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。随着发展势头和投资持续，Jaffe博士和及其研究小组发现当产生 病人特异性的干细胞系时，病人细胞样品的来源位置和年龄是重要的考虑因素。

产生病人特异性的干细胞的最为常用的细胞是源自皮肤的细胞，而且它们潜在地接受了最高的环境暴露。LIBD研究人员比较了来自死后大脑硬脑膜（dura mater）的成纤维细胞和来自同一些人皮肤样品的成纤维细胞。尽管这些细胞在显微镜看起来是相同的，但是这项研究鉴定出广泛的表观遗传差异和基因表达差异，这提示着这些细胞对它们在体内的原始位置保持着强大的表观遗传记忆。此外，研究人员发现这些细胞的原始位置也与供者的年龄显著相关联。Jaffe博士注意到，“据我们所知，这是首次证实由这些原始的细胞经过多次细胞分裂产生的纯细胞群体发生显著性的年龄相关变化。”

这项研究的结果证实来自硬脑膜的和来自皮肤样品的成纤维细胞在一生当中存在显著的差异。随着个人化医疗持续发展，这一发现进一步证实还需研究用于再生新组织和器官的干细胞的表观遗传模式。另外，当制造iPSCs时，还需进一步研究确定需要培养哪些细胞和何时培养它们，以便确认实际上有多少表观遗传记忆被清除。（PLoS Genetics, doi:10.1371/journal.pgen.1005819）

5. Nat Commun：三种干细胞制造技术被证安全

在一项新的研究中，来自美国斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute, TSRI）和克雷格文特尔研究所（J. Craig Venter Institute, JCVI）等多家机构的研究人员证实制造临床使用的多能干细胞的方法不可能将致癌基因突变传递给患者。相关研究结果于2016年2月19日发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“Whole-genome mutational burden analysis of three pluripotency induction methods”。这项研究是评估快速发展中的干细胞疗法对病人安全性的重要一步。

这项新的研究着重关注在病人体内使用诱导性多能干细胞（iPSCs）的安全性。因为iPSCs能够分化成体内任何一种类型的细胞，它们有潜力修复因擦伤或诸如帕金森病和多发性硬化症之类的疾病带来的损伤。

为了制造出iPSCs，科学家们必须对诸如皮肤细胞之类的成体细胞进行重编程让它们表达一套不同的基因，这可通过使用作为运输载体的病毒或信使RNA（mRNA）分子来实现。

研究人员研究了三种流行的iPSCs制造方法：整合性逆转录病毒载体，非整合性仙台病毒和人工合成mRNA，评估了每种方法触发致癌基因突变的潜力。虽然研究人员在iPSCs中注意到一些小的变动，但是这些方法中没有一种导致显著性的突变。他们对这些实验再重复了两次，结果再次没有发现显著风险。

不过这些研究人员确实发出提醒：尽管iPSCs在重编程过程中未获得致癌基因突变，但是潜在有害的突变能够在iPSCs随后的实验室增殖中积累。Loring说，科学家们在将他们的细胞用于临床治疗之前必须分析是否存在这些有害突变。（Nature Communications, doi:10.1038/ncomms10536）

6. The Lancet：首次报道人类胚胎干细胞治疗疾病的安全性及有效性

近日，刊登在国际杂志The Lancet上的一篇研究论文中，来自美国先进细胞技术公司的首席科学家Robert Lanza教授揭示了人类胚胎干细胞（hESCs）在治疗人类疾病领域中从中期到长期都具有一定的安全性。

文章中，研究者表示，在hESCs移植入18位患有不同形式的黄斑变性患者机体中三年后hESCs移植疗法依然具有一定的安全性，而且这种干细胞移植技术可以使得超过一般的患者恢复部分视力。胚胎干细胞具有分化为机体任何类型细胞的能力，但是如果将其移植入机体中就会发生引发很多问题，比如畸胎瘤形成的风险及免疫排斥等问题。

在两个1/2阶段的研究中，研究人员使hESCs分化成为视网膜色素上皮细胞，并且将其移植入9位患斯塔加德黄斑营养不良症的患者及9位干萎缩性年龄相关的黄斑变性患者机体中，目前针对上述疾病并无有效的治疗手段，这些患者眼部的视网膜中的光感受器会变性最终引发患者完全失明。

文章中，所有的参与者都被注射了三种不同剂量视网膜细胞中的一种，即5万、10万及15万个视网膜细胞，这些视网膜细胞被注射到了患者的眼睛患处的视网膜下间隙。研究者Steven Schwartz教授表示，我们的研究结果揭示了hESCs在治疗人类眼部退行性疾病上的潜力及安全性，也为我们后期利用hESCs进行更多人类疾病的治疗提供了更多的帮助和研究思路。（The Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(14)61376-3）

7. Cell Stem Cell：干细胞用于再生医学可能是安全的

引申阅读：Cell子刊：首次分离到初生胚胎干细胞，可用于治疗唐氏综合征

剑桥大学研究人员发现了迄今为止最有力的证据，表明人类多能干细胞（human pluripotent stem cells）被移植入胚胎后将正常发育。这些研究结果2015年12月17日发表于《Cell Stem Cell》期刊，对再生医学具有重要意义。

人类多能干细胞(hPSC) 在成年人的身体中可以发展成为任何类型的细胞， 它对心血管到阿尔茨海默氏症的疾病建模中进行的药物研发和创造替代细胞提供了巨大的潜力。

但这样会有风险：移植hPSCs也可能发展成为肿瘤。2015年11月10日发布的一项新的研究结果表明，新的“祖细胞能无限扩张和分化成成熟的肾脏细胞，但没有形成肿瘤的风险。”

Karl Willert博士说， “这项工作在组织工程或重建功能器官中起到很好的补充作用，如我们所看到的微型肾，它代表了一种新型的细胞来源。”

Willert设计了一种体外微环境，该环境可使早期胚胎发育的三个主要胚芽层之一的中胚层祖细胞hPSC同质扩张。胚芽层是一种在胚胎发生的主要层细胞。早期祖细胞是干细胞的后代，分化能力有限。

用于再生医学或生物医学研究的人类多能干细胞主要有两个来源：胚胎干细胞和诱导多能干细胞。人类多能干细胞被视为有希望被疗法性用于再生医学，治疗影响各种器官和组织的毁灭性疾病，尤其是那些再生能力比较差，比如心脏、大脑和胰腺等脏器中的疾病。

不过，有些科学家一直担心这些细胞可能无法适当地融入身体，因而不能按照要求增殖和分布，导致肿瘤。最新的这项研究表明，这种情况不会发生，这些干细胞在被适当地移植时，用于再生医学可能是安全的。

剑桥大学Anne McLaren再生医学实验室教授Roger Pedersen在评论共同作者Victoria Mascetti的研究发现时表示：“我们的研究提供了强有力的证据，表明人类干细胞将以正常而安全的方式发育。这可能是再生医学领域一直在等待的消息。”（Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2015.11.017）

8.诱导多能干细胞人体试验在全球科学界激起波澜

“这是令人敬畏的、疯狂的，我非常激动，我一直在等待它的到来。”美国加利福尼亚州拉荷亚斯克利普斯研究所干细胞生物学家Jeanne Loring说。她是全世界欢迎干细胞疗法新消息的几位研究人员中的一位——存在视觉缺陷的一位日本女性成为接受诱导多能干（iPS）细胞疗法的第一人。

如果该过程被证明是安全的，它可以软化其他国家对iPS细胞人体试验的管理态度，并将为治疗帕金森氏病和糖尿病等其他疾病铺平道路。它还将巩固饱受干细胞丑闻困扰的日本的iPS细胞研究领跑者的地位。

尽管如此，人们对iPS细胞制备的组织也有担忧，这可能阻止各国批准临床试验。身体里的免疫系统将会攻击它们，或者它们之中仍包含一些处于可塑状态的细胞，并导致癌症性生长，尽管Loring指出，这种情况并没有在胚胎干细胞疗法人体试验中发生——人们也曾对该细胞有类似的担忧。

2013年7月，日本管理机构批准理化学研究所（RIKEN）发育生物学中心（CDB）眼科医生Masayo Takahashi领衔的研究小组收集细胞用于临床iPS细胞初步研究。

她的研究团队提取了上述患者的皮肤细胞，这位现年70岁的女性因老年性黄斑变性而出现视网膜损伤。之后，研究人员重新改编了皮肤细胞，使其成为iPS细胞，并诱导这些细胞变成视网膜组织。9月8日，Takahashi提供证据显示，这些细胞具有遗传稳定性和安全性——这是它们能被移植入眼睛的先决条件。手术在4天后进行，RIKEN报告称患者没有出现不良反应。

不过，在该实验中，这位女性患者的视力不太可能改善。但全世界的研究人员都在观望这些细胞能否阻止视网膜进一步退化，以及是否出现副作用。如果该患者经历严重后果，iPS细胞研究将后退数年，正如基因疗法经历的那样：1999年，一位患者在利用改编基因修正一种肝病的试验中死亡。“这让我在夜里辗转反侧。”Loring说。

但如果Takahashi的试验能成功，这将对FDA和欧洲药品局等管理机构释放出一个强有力的信号。“假如Masayo能证明这些细胞对患者而言是安全的，将能缓解对新细胞类型的焦虑。”马里兰州贝塞斯达国立眼科研究所发育分子生物学家Kapil Bharti说。Bharti正在领衔国立卫生研究院（NIH）开发针对黄斑变性的iPS细胞疗法的研究。该疗法与Takahashi使用的方法类似。他希望能在2017年获得FDA批准，进行临床试验。

9.诱导多能干细胞（iPSc）发展面临的几个问题

自2006年问世以来，诱导多能干细胞（iPSc）的发展可谓一路高歌，相关论文层出不穷，然而，就在其高歌猛进之际，却传来了不和谐的声音。最近，不断有科学家撰文指出其发展过程中可能会遇到几只“拦路虎”，诱导多能干细胞开始遭遇“成长烦恼”。

在科学发展史上，5年不过一瞬间，但是，希望通过重组成人细胞以彻底革新再生医学的美好愿景从概念的提出到现在几乎成为现实也不过5年。2006年8月，日本东京大学的科学家山中伸弥首次利用病毒载体将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和Myc）的组合转入老鼠分化的体细胞中，使其重新编程而得到了类似胚胎干细胞的一种细胞类型——诱导多能干细胞，其可以变成任何类型的细胞。第二年，山中伸弥使用人类皮肤重复了该实验并取得了成功。

诱导多能干细胞拥有明显的优势：它们可使用成人的细胞制成，不需要人类的胚胎，避免利用人类胚胎制造多功能干细胞饱受的争议；诱导多能干细胞可用从罹患某种疾病的患者身上提取的组织或细胞制成，这样，科学家们就可以根据该病人的基因，“量体裁衣”地为其设计治疗方案。

科学家们认为，这种通过将完全分化的体细胞重编程，不经胚胎阶段而直接逆转至多功能干细胞状态的诱导多能干细胞，在再生医学领域拥有重要的应用潜力，在药物筛选方面也将“大展拳脚”。

然而，过去几个月内，不断有科学家发表论文指出，其最新研究成果表明，诱导多能干细胞的发展遇到了几只“拦路虎”。首先，细胞重组的效率可能很低，或许还会诱发基因变异；其次，经过重组的细胞也无法发育成任何类型的细胞；此外，诱导多能干细胞制造出的细胞并非都可以用于治疗疾病等等。

实验中，新问题也逐渐浮现出来。科学家近日发表的研究结果表明：当将使用某些老鼠的细胞制成的诱导多能干细胞移植入其他基因组成相同的老鼠体内时，产生了免疫反应，这就提出了一个问题——是否能将诱导多能干细胞制造出的身体组织注入为其制造提供原材料的人体内？

没有人怀疑诱导多能干细胞拥有的巨大潜力，但是，该领域的很多专家最初怀抱的乐观现在已开始慢慢降温。

从一开始，生物学家就试图设计出比山中伸弥的方法更安全、更有效的方法来制造诱导多能干细胞。山中伸弥使用一个逆转录酶病毒将四个基因重组因子递入细胞中。逆转录酶病毒会整合进入一个宿主细胞的DNA（脱氧核糖核酸）中，因此，其会潜在地中断基因表达并诱发癌症；而且，编程因子Myc本身就是一个会引发癌症的致癌基因。

尽管新的、“经过改进的”重组方法似乎层出不穷，但迄今为止，山中伸弥的逆转录酶病毒方法仍然是最有效以及使用最广的。其能将0.01%的人体皮肤细胞经过重组转化为诱导多能干细胞。相反，并不会被整合入基因组中的腺病毒只能将0.0001%到0.0018%的皮肤细胞转化为诱导多能干细胞。转化效率低下增加了使用各种细胞制造诱导多能干细胞的成本和难度，尤其是当某些细胞来源比较少时，难度和成本更高。

研究人员也曾经尝试过让Myc消失，或者一旦重组完成就使其沉默或将其从细胞中剔除，但这些措施同时也降低了重组效率，而且，被沉默的Myc也可能被重新激活。

这些已经成为该领域的科学家现在着手解决的主要问题。科学家们绞尽脑汁地在对他们的重组方案进行修修补补，试图找到最有效而且也不会增加癌症风险的因子和递送手段。

今年4月，美国宾夕法尼亚大学医学院医学、细胞和发育生物学教授兼再生医学研究所科学主管爱德华·莫里西领导的科研团队报告称，他们首次绕开四个转录因子生成了诱导多能干细胞，并将重编程效率提高了100倍。在采用微RNA（microRNA）替代四个关键的转录因子之前，研究人员每重组10万个成体细胞只能获得不到20个的极少数诱导多能干细胞。在最新研究中，科学家们利用微RNA新技术诱导10万个人类成体细胞，生成了大约1万个诱导多能干细胞。

美国加州斯克利普斯研究所的发育神经生物学家詹纳·娄伦表示：“对我们来说，让这些新的重组方法很好地工作，以使我们能查看其在细胞的稳定性和致癌风险方面是否与之前的方法有所不同非常重要，还没有人做过类似的尝试，还需要很长时间不断将这些研究推进。”

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