专家论坛｜王贵强：间充质干细胞治疗自身免疫性肝病的临床研究进展

自身免疫性肝病(AILD)是一类由自身免疫反应异常导致肝细胞和/或胆管上皮细胞损伤的慢性肝胆系统炎性疾病，其临床表现按照其病理学和发病机制可以分为三类：自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)^[1-4]。这三种AILD临床表现多样，其中疲劳、食欲不振、肝脏不适和巩膜黄染比较常见，并导致血液检查中肝功能指标异常。此外，与自身免疫性疾病最突出的特征一致，AILD患者会产生自身抗体。

最近几年的研究强调了细胞治疗在临床应用中的巨大潜力，特别是间充质干细胞(MSC)治疗，由于其诸多优点而成为一种有前途的治疗方法，并得到了大量的研究关注。MSC存在广泛，有自我更新及多项分化潜能，可以产生脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和肌成纤维细胞的祖细胞等，以适应机体炎症信号和分化的需要^[5]。由于MSC具有多谱系分化潜能、调节免疫反应的能力、易于接触源组织和优异的体外繁殖能力，已被认为是治疗组织再生、自身免疫性疾病和高炎症性疾病的理想来源。

许多研究^[6-11]已经证明了MSC治疗不同疾病的安全性和可行性，包括移植物抗宿主病、急性呼吸窘迫综合征、心血管疾病、癌症、骨关节炎、糖尿病和肝硬化。特别是抗纤维化、免疫调节和肝细胞分化特性使MSC有望成为治疗AILD的候选药物。近年来，MSC在治疗自身免疫性疾病方面也开始发挥巨大作用。本文介绍了最近MSC治疗AILD的临床研究进展，详述MSC治疗AILD的机制原因，简述开发该新型疗法的临床应用所面临的挑战。

1、MSC在AIH中的治疗进展

AIH在女性发病率较高，组织学表现为高IgG、高自身抗体、界面性肝炎等^[12]，主要有两种类型: 抗核抗体和/或抗平滑肌抗体阳性为1型，而抗肝肾微粒体抗体1型和/或抗肝细胞质1型自身抗体阳性为2型^[13]。其治疗通常选择激素和免疫抑制剂疗法，但是停药易复发，最终迁延为肝纤维化和肝癌^[14]。其中AIH在AILD中发病率较高，对于AIH的治疗，通常用类固醇来缓解诱导，硫唑嘌呤常用于缓解维持^[15]。其他AIH的二线和三线治疗药物，如霉酚酸酯和他克莫司，是对标准疗法反应不足或不耐受的AIH患者的选择。然而，这些免疫抑制药物会引发许多不良反应，包括库欣样特征、感染、骨质疏松症和胃肠道问题^[16]。

目前，AIH的临床试验开展较少，其中一项适应性、多中心、Ⅱa期、多疾病临床试验(NCT02997878)正在进行，该试验由英国伯明翰大学发起，以探究单次输注人脐带血来源的MSC治疗PSC和AIH患者的安全性和药物活性。入组AIH患者要求≥18岁，有明确AIH临床诊断，符合AIH的肝活检结果，并且血清学结果符合入组和排除标准。该临床试验选择单次静脉注射MSC共3个剂量水平，分别评估此疗法对于AIH患者的疗效。通过后期监测严重不良事件、不良事件发生率、剂量限制毒性来确定此疗法的安全性和耐受性。第一阶段监测ALT水平，第二阶段监测肝脏生化学和功能的相关指标，包括AST、ALP、GGT、胆红素、白蛋白、INR和MELD评分的基线变化，免疫球蛋白G，无创纤维化标志物(增强肝纤维化评分)和瞬时弹性成像，以及瘙痒目测模拟量表、9点疲劳严重程度量表和SF-36v2以测评其生活质量，其他相关的评测指标：免疫激活的标志物包括免疫球蛋白和C反应蛋白、胆道损伤标志物包括总胆汁酸水平、血清细胞因子和趋化因子谱、通过qPCR或等效技术测量循环细胞中的RNA和微RNA谱，最终临床试验结果尚未发布。

2、MSC在PBC中的治疗进展

在PBC中，免疫系统会错误地攻击胆管，主要是肝脏中的小胆管受到损害。随着胆管被破坏，胆管所携带的物质会积聚在肝脏和血液中，引起瘙痒、疲劳和代谢问题。在PBC晚期，可导致肝硬化^[17]。熊去氧胆酸(UDCA)是主要的治疗药物，已被证明可以减缓疾病进展，对改善胆道功能有一定疗效，但25%~50%的PBC患者无法从UDCA治疗过程中获得完全的治疗反应。由于其他PBC药物可能会影响UDCA的吸收，可采用奥贝胆酸(OCA)治疗；对于一些仅对UDCA治疗无反应的患者，可应用贝特类降脂药物^[18]。

MSC作为PBC新疗法的前沿药物，已有2项完成的临床试验。2011年，由脐带来源的间充质干细胞(UC-MSC)是否以及如何改善PBC患者病情的临床试验(NCT01662973)开展。2013年发布试验结果：研究纳入7例对UDCA治疗反应不佳的PBC患者，将培养的UC-MSC按照0.5×10⁶/kg通过外周静脉输注给PBC患者，每隔4周给予3次UC-MSC静脉输注，随访48周。试验结果显示大多数患者经UC-MSC治疗后，疲劳、瘙痒等症状明显缓解。与基线相比，随访结束时ALP和GGT水平显著降低，梅奥风险评分在治疗和随访期间保持稳定，并且UC-MSC治疗未见明显副作用。UC-MSC输注在对UDCA治疗只有部分反应的PBC患者中是可行的，且耐受性良好^[19]。2014年的一项临床试验评估了异基因骨髓来源的MSC移植(BM-MSCT)治疗UDCA耐药的PBC患者的安全性和有效性，10例入组患者均被允许同时继续之前的UDCA治疗。在MSC输注后1、3、6、12个月进行随访评估。随访结束后，未观察到与移植相关的副作用，BM-MSCT后患者的生活质量得到改善。BM-MSC输注后血清ALT、AST、GGT和IgM水平较基线显著降低。外周淋巴细胞亚群中CD8⁺T淋巴细胞比例降低，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T淋巴细胞比例增加，血清IL-10水平升高。值得注意的是，BM-MSC治疗后3~6个月获得最佳治疗效果，并可维持12个月。总之，异基因BM-MSC治疗UDCA耐药的PBC患者是安全有效的^[20]。

3、PSC的临床治疗困境

PSC是一种罕见疾病，在普通人群中患病率为6/10万~16/10万人，其特点是损伤肝内和肝外的大胆管，导致胆道狭窄和扩张，是一种涉及肝内和肝外胆管的炎性纤维化疾病，最终导致胆汁性肝硬化和门静脉高压^[21]，PSC通常与炎症性肠病相关，包括但不限于溃疡性结肠炎或克罗恩病^[22]。尽管PSC的发病机制尚不确定，但有证据表明，源自肠道的细菌或细菌产物具有刺激作用，并伴有某些遗传因子的自身炎症反应，目前尚无有效的治疗方法。在严格的标准下，肝移植是合并终末期肝病(肝细胞癌或胆管癌)PSC患者的一种选择，肝移植术后10年复发的风险约为20%^[23]。因此探索新的疗法对于PSC来说，临床意义重大。MSC是否可以针对PSC患者进行临床试验，目前相关研究正在进行中。

4、MSC治疗AILD的机制

4.1   MSC和MSC的细胞外囊泡(MSC-EV)通过免疫调节减轻肝脏炎症

MSC可能通过其免疫调节功能抑制炎症，促进肝细胞存活，减轻肝纤维化和延缓肝脏疾病进展^[24]。越来越多的证据强调了MSC及其外泌体在免疫调节中的作用。目前普遍认为MSC通过旁分泌途径发挥免疫调节功能，其中细胞外囊泡(EV)是最具可能的有效途径。EV是具有磷脂双分子层膜的细胞分泌的囊泡，能够通过转移膜和细胞质蛋白质、脂质和RNA介导细胞间信号连接^[25]。与MSC相比，MSC-EV体积更小，具有治疗上的便捷性。MSC可以通过多种方式与肝脏中的免疫细胞相互作用，也可以通过细胞因子的分泌等调控炎症和促进肝脏再生^[26]。研究^[27]表明MSC可以有效抑制先天免疫系统细胞的激活。

MSC-EV可减少促炎细胞(M1巨噬细胞、CD8⁺T淋巴细胞、Th1和Th17细胞)的增殖，下调IL-1β和抑制IL-6的释放，增加抗炎亚型M2巨噬细胞的比例，并能抑制适应性免疫细胞的激活，包括T淋巴细胞亚群^[28]和B淋巴细胞亚群等^[29]。此外，MSC可通过分泌一系列抗炎分子抑制T淋巴细胞增殖，如一氧化氮、吲哚胺2, 3-双加氧酶(IDO)、前列腺素E2、IL-10、细胞死亡配体1 (PD-L1)、TGF-β1、血红素加氧酶-1、肝细胞生长因子(HGF)、半凝集素等^[30-36]。MSC可抑制细胞毒作用CD8⁺T淋巴细胞的活化，自身表达高水平的IDO，从而抑制活化T淋巴细胞的增殖^[37]。同时MSC还可以通过细胞凋亡因子/配体(Fas/FasL)途径促进T淋巴细胞凋亡，诱导CD4⁺CD25⁺FOXP3 Treg分化^[38-39]。研究表明BM-MSC对B淋巴细胞也有调节作用。淋巴素β受体信号通路与TNF和IL-1受体信号通路联合，可下调IL-17的表达，从而在全身炎症期间阻碍淋巴细胞生成^[40]。MSC还可以调控调节性B细胞(Breg)分化。脂肪组织来源的MSC能够促使B淋巴细胞分化为Breg并分泌IL-10，对T淋巴细胞具有不依赖于IL-10分泌的活化调节作用^[41]。早期研究表明，MSC可以通过阻断G0/G1期的细胞周期和直接接触PD-1/PD-L1通路抑制B淋巴细胞的增殖。MSC可以分泌CCL2，抑制浆细胞中的信号通路转录激活因子3 (STAT3)的激活，促进PAX5的表达，从而抑制B淋巴细胞中IgG的产生^[42]。另一方面，MSC可诱导IL-10的产生调控CD19⁺ CD24^highCD38 Breg活性^[43]。此外，MSC-EV主要积聚在肝脏^[30]，能够通过逆转AIH中Treg的下降，促进肝脏免疫稳态，缓解肝脏炎症。

另外，MSC-EV可显著降低促炎细胞因子IL-2的表达，同时增强抗炎细胞因子TGF-β、HGF等mRNA的表达。肝脏的Kupffer细胞在吞噬MSC-EV后产生TGF-β等细胞因子，进而促进Treg的产生，从而抑制肝脏炎症^[44]。有文献报道了MSC-EV的miR-223-3p可以降低脂多糖诱导的巨噬细胞炎症相关基因STAT3和p-STAT3的表达，可抑制幼稚T淋巴细胞向Th17细胞分化。因此，MSC-EV处理后Tregs/Th17细胞比例增加，可以缓解AIH炎症反应^[45]。而MSC-EV中的miR-223被证明可以降低炎症小体NLRP3和Caspase-1水平，从而减少肝细胞的凋亡。而过表达miR-223的BM-MSC可以抑制转录因子STAT3和p-STAT3表达，导致小鼠炎症模型血清中ALT和AST水平显著降低，以及炎症因子水平的降低^[46]。IL-35被认为是一种抗炎细胞因子，在人和小鼠Treg中高度表达^[47]，IL-35-MSC治疗可抑制细胞凋亡，有相关研究^[48]表明，用IL-35基因修饰的脂肪组织来源的MSC治疗AIH模型小鼠发现，肝单个核细胞的凋亡标志物如FasL和促炎细胞因子如IFN-γ和IL-17显著减少。在聚肌苷-聚胞苷酸钠(Poly I∶ C)诱导的PBC小鼠模型中同样验证了BM-MSC治疗的效果，可能的分子机制可能与TGF-β和Treg的相互作用有关，接受MSC治疗的小鼠外周血和淋巴结中Treg含量增加，血清中TGF-β水平升高，而TGF-β是一种促进Treg分化的细胞因子。最终导致模型小鼠血清ALP水平降低、浸润肝脏胆管上皮的淋巴细胞也明显减少，抑制了免疫细胞在肝脏的增殖和浸润^[35]，从而减轻了肝脏炎症^[49]。

4.2   MSC在肝细胞再生中的作用机制

MSC可分化为肝细胞，同时MSC也可作为间质支持细胞，可通过其分泌的外泌体靶向损伤位点，以恢复肝脏内稳态，并使肝细胞功能恢复、修复和再生^[50]。研究表明，MSC在肝损伤过程中，可以迁移到损伤部位。MSC对肝损伤释放的趋化因子有刺激作用，如基质细胞衍生因子^[51]、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子^[52]。MSC表达大量趋化因子受体，可通过炎症趋化因子和细胞因子而在炎症部位“安家”，MSC表面的CD44可使其与内皮细胞上的E -选择素结合，到达靶区^[53]。这一过程促进了肝损伤时受损细胞的再生。MSC迁移到肝脏的能力有限。但MSC可以通过旁分泌作用促进血管生成，这是MSC再生的另一个主要机制。体外实验^[54]表明，不同来源的MSC可以促进静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，增强受损组织的供氧、营养和生长因子释放，从而促进受损组织的再生。

5、MSC治疗AILD的挑战和展望

MSC通常被认为是一种安全的治疗策略，可用于AILD等慢性肝病患者，目前的临床试验包括肝衰竭、酒精、HBV或HCV引起的肝硬化以及原发性胆管炎等。然而，为了使MSC成为治疗上述肝脏疾病的临床选择，还需要进一步可靠的随机临床研究来提高疗效，验证其可靠性。此外，为了提高MSC的疗效，还需要进一步研究最佳的给药途径、足够数量的MSC以及延长移植的MSC在患者体内的生存期等。同时，MSC的低迁移和多样分化潜能，MSC的最佳来源，以及发生肿瘤和病毒传播的风险等问题也需要解决。总之，希望MSC治疗能给更多的AILD患者带来新的希望。

全文下载:

史婉婉, 钱建丹, 王贵强. 间充质干细胞治疗自身免疫性肝病的临床研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2023, 39(5): 1004-1009