Environ Res：基因测序显示武汉爆发之前，新冠病毒早已在全球传播！

摘要：美国曾将新冠病毒污名化为“武汉病毒”，严重影响中国国际形象！随着疫情的发展，意大利科学家在对疫情前的麻疹病人皮肤活检样本检测时，发现大量新冠病毒阳性样本和抗体，意味着早在2019年6月，甚至更早时期，意大利已出现新冠病毒传播！局限于新冠病毒在当时的未知性，无法进行基因检测确定新冠传播。新冠导致的皮肤病（如：荨麻疹、湿疹和风疹等）案例暴增引起了科学家们的高度重视。如今回顾新冠爆发前期的皮肤病案例，意大利科学家重新评估了新冠感染与麻疹样综合征之间的关联，为未检测到的新冠病毒早期传播提供了关键性证据。

此前的证据，大部分在早于中国武汉的患者样本中发现有“新冠病毒抗体”，但是抗体有假阳性的可能。而最新的研究发现，在早于武汉的样本中发现了新冠病毒RNA存在的证据，这是最可靠的证据！

2019年12月1日，中国出现首例新冠肺炎病例，该病例为一名70多岁患病在家的脑梗塞患者，且未去过华南海鲜市场。2019年12月31日，中国武汉市卫健委确认肺炎病例为一种新型冠状病毒感染。由此，新冠肺炎正式进入世界视野。SARS-CoV-2在中国首次被分离出来，分子实验表明，SARS-CoV-2很可能从蝙蝠宿主中传播到人类身上，且可能在中国武汉首次爆发之前已经发生传播。

2020年1月中旬，欧洲和北美国家相继报告新冠病例。意大利是第一个报告新冠病毒社区传播的欧洲国家，随后成为欧洲新冠流行的中心，其中伦巴第受影响最严重。同时期在意大利首次发现且在伦巴第大区以及欧洲大部分地区流行的新冠毒株与武汉发现的毒株并不相同。其实，早在2019年10月在伦巴第大区收集的样本中就发现了先前报道于2020年1月出现的B.1毒株的典型突变（C3037T、C14408T和A23403G）。

意大利：新冠在武汉爆发之前，已发生全球传播

一些证据表明，新冠病毒在被识别之前已经在不为人知的情况下传播了一段时间。2019年12月下旬在意大利北部和2019年11月在巴西的废水中均检测到了新冠病毒RNA；通过抗体检测的间接证据表明法国、意大利、英国、美国和安哥拉均已在2019年发生新冠传播；2019年12月，在一名因咯血住院的法国患者的呼吸道样本、米兰（伦巴第）一名疑似疑似患者的口咽拭子和因急性循环功能不全而死亡的一名患者的血液和肺部中均检测到新冠病毒RNA；在意大利米兰患有皮肤病的女性的石蜡包埋皮肤活检中检测到了新冠病毒和抗原，而该样本的采样时间为2019年11月。

在伦巴第经常观察到感染新冠的患者会出现多种皮肤表现，通常以迟发为特征，并且具有可变的持续时间、严重程度和预后。这些表现在新冠传播的背景下造成诊断困难，因为可能出现在任何疾病阶段。即使在没有呼吸道症状的情况下也可能出现皮肤表现，但当出现皮肤表现时，患者的呼吸道拭子可能呈RNA阴性。

在新冠爆发前的2019年，意大利麻疹和风疹疑似病例是前两年平均水平的两倍。此外，疑似麻疹和风疹病例的比例稳步上升，从第一次大流行开始时的30%左右上升到70%，到2021上升到100%，提示这些皮肤表现背后发生了系统性病因改变（图1）。这些反常数据引起了意大利科学家的注意。

图1 2017年-2021年，意大利麻疹和风疹流行病学趋势（图源：[1]）

注：调查的麻疹/风疹疑似病例数用灰色条表示，丢弃的麻疹/风疹疑似病例百分比（阴性诊断的疑似病例）用黑线表示。星号表示由于封锁措施而中断监视活动的时期。

2022年8月25日，意大利米兰大学研究团队在Environmental Research发表题为“Molecular evidence for SARS-CoV-2 in samples collected from patients with morbilliform eruptions since late 2019 in Lombardy, northern Italy”的研究成果（图2）[1]。研究结果表明能够产生麻疹样综合征的新冠祖病毒可能于2019年6月下旬至7月下旬已经在意大利出现；新冠肺炎在武汉第一次爆发之前，B.1毒株可能已经在全球传播。

图2 研究成果（图源：[1]）

伦巴第地区麻疹和风疹监测地方参考实验室（MoRoNet）每年都会收到来自出现麻疹样皮疹的患者的口咽拭子或尿液样本，进而进行检测分子和血清学诊断。此项研究基于MoRoNet自2018年8月以来收到的所有麻疹/风疹阴性患者（丢弃病例）的样本数据，对从156例病例中采集的435份样本（148份口咽拭子、141份尿液样本和146份血清样本）进行了新冠感染调查、分子测序和血清学检查。其中包括2019年8月（首次注意到丢弃的麻疹风疹病例意外增加）到2020年2月下旬大流行开始（大流行前病例）之间收集的44个病例的样本，以及2020年3月到2021年3月（大流行病例）之间收集的12个病例的样本，以及2018年8月至2019年7月期间收集的100例病例的样本（对照组）。这些样本是在首次初步诊断麻疹或风疹时收集的，此时即使没有呼吸道症状，皮肤表现也很明显。

结果表明：

新冠流行前样本阳性率达25%，最早的阳性样本时间为2019年9月

在13名受试者中发现了新冠感染的分子证据：大流行期间病例的阳性率为16.7%（2/12），大流行前病例的阳性率为25%（11/44）。13名患者中有6名（46.2%）在尿液中发现了新冠病毒RNA，而其余7名患者（53.8%）在呼吸道样本中发现了新冠病毒。第一个新冠病毒RNA检测呈阳性的样本是在2019年9月12日收集的来自8个月大儿童样本（尿液、血清IgG和IgM均阳性）。该样本在嵌套PCR后变为阳性，并且没有样本在实时PCR诊断方案中检测为阳性，这表明在检测阈值处病毒载量较低。

新冠流行前36%阳性样本中检测到新冠抗体

新冠大流行前时期的11名新冠阳性样本中有4份的新冠抗体检测呈阳性，IgM是最常检测到的抗体类别。此外，在新冠大流行期间患病的两名受试者中检测到中和抗体均为新冠RNA阴性。有趣的是，与样本采集日期无关，在5名1岁或以下的阳性儿童中检测到抗体，而1岁以上的8名患者中只有2名ELISA结果阳性，而且他们都是大流行期间的患者。

皮疹发作前两周，阳性患者无出国旅行史且患者间无流行病学联系

在皮疹发作前的两周内，没有阳性患者报告有任何出国旅行史，并且患者之间没有已知的流行病学联系。首例大流行前病例主要位于米兰东部和布雷西亚，而后来的病例则出现在米兰西北部。科莫、蒙扎-布里安扎和瓦雷泽没有报告病例，这些城市在第一波疫情期间没有受到新冠的特别影响。11例大流行前病例中有5例发生在2019年10月12日至23日期间。大流行病例主要集中在米兰，且全部在2021年头几个月被发现。

2019年10月，意大利采样病毒已存在武汉采样不存在的新变异

研究总共获得了15个序列，其中12个来自大流行前的病例。每次测序都观察到病毒的三个主要突变（C3037T、C14408T和A23403G），这三个突变在中国疫情爆发几周后才首次检测到，而意大利已在2019年10月检测到。这表明意大利从2019年10月开始的新冠病毒序列已经携带了在中国武汉第一次采样中不存在的突变。七个部分S序列中的六个与参考序列武汉-Hu-1 100%相同。

从病毒变异推断：新冠病毒可能从2019年6月开始在意大利传播

三种常见突变（C3037T、C14408T和A23403G）属于β组突变。所有具有β突变的全球循环基因组也携带三个⍺突变（T18060C、T8782C和C28144T），推断意大利采集到的β组新冠病毒在存在时间上先于中国武汉采集的⍺组新冠病毒。突变顺序分析预测这些突变很可能存在于大流行前的毒株中，这意味着这些毒株可能与推断的祖代新冠病毒相距至少六个突变毒株并属于αβ谱系，它产生了当今流通的几乎所有主要后代毒株。

图3 意大利检测到的新冠病毒突变示意图（图源：[1]）

由于2019年10月17日收集的样本中存在所有三种β突变，研究估计祖代新冠病毒可能在10月17日之前已经存在11.6-16.2周，即2019年6月下旬至2019年7月下旬新冠病毒已经在意大利传播。

麻疹与新冠感染之间存在明显关联

尿液中病毒RNA的鉴定表明，全身性感染可能与麻疹样皮疹的发展同时发生，呼吸道样本中的低可检测性可能反映了经常观察到的皮疹与呼吸道相关的变化（之前或之后）。

此项研究首次提供了从2019年12月之前收集的临床样本中获得的新冠病毒序列信息。该结果对全球澄清导致新冠肺炎出现的事件链具有潜在的指导意义。研究强调了健全的监测系统在流行病爆发时的管理以及作为回顾性调查病原体传播早期阶段工具方面的关键作用。研究人员表示：“大量已发表的关于新冠病毒的论文中，只有少数文章专门探讨了病毒的起源。在中国和其他有证据表明早期新冠病毒传播的地区，迫切需要进行进一步的回顾性调查，这也被世界卫生组织列为重点研究领域之一。我们建议在病毒起源调查期间应考虑更广泛的地理区域和时间跨度。”

研究的局限性包括被调查的患者数量相对较少，样本不是在呼吸道疾病监测的框架内收集的，并且病毒载量较低。此外，初步数据必须通过后续研究来补充，需要采用宏基因组方法从检测到的毒株中获取更多序列信息，以研究病毒进化历史并更准确地估计病毒引入的时间。

参考资料：

[1]Amendola A, Canuti M, Bianchi S, et al. Molecular evidence for SARS-CoV-2 in samples collected from patients with morbilliform eruptions since late 2019 in Lombardy, northern Italy. Environ Res. 2022 Aug 24:113979. doi: 10.1016/j.envres.2022.113979. Epub ahead of print. PMID: 36029839; PMCID: PMC9404229.

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