Cell：腹泻、肠炎...这种病菌如何让你肚子疼？西湖大学Cell论文揭示其侵入人体的分子机制

导读

科学研究有时候就像福尔摩斯破案，面对看不见摸不着的对手，需要大胆假设，小心求证，外加细致入微的观察。

西湖大学的陶亮博士最近遇上了一个棘手的对手——“艰难梭菌”。这是一种造成医院和社区的病人感染腹泻及肠炎的重要病原体，近年来在全球各地造成了一系列的爆发性感染，被美国疾病预防控制中心列为最高级别威胁的耐药病菌。

陶亮对此跟踪研究了9年。从2013年在哈佛医学院做博士后至今，他一直在研究包括艰难梭菌在内的病原细菌与宿主之间的相互作用。简单说，就是解释艰难梭菌如何入侵人体并致病。

现在，陶亮博士的团队有了新的重要发现。

北京时间2022年3月17日23点，西湖大学生命科学学院陶亮团队与施一公团队合作，在《细胞》（Cell）在线发表了题为“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2？C. difficile”的最新研究成果，首次揭示了超毒力分支艰难梭菌毒素B的肠道上皮受体——TFPI蛋白。

这意味着，他们发现了艰难梭菌毒素B入侵人体的新“大门”。

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为什么盯上艰难梭菌？

艰难梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性细菌，因为分离培养比较困难，所以得名“艰难”。

它普遍存在于环境中，包括空气、水、土壤、动物和人类的粪便中。而人体肠道内也是一个它适合定居的场所。

艰难梭菌感染之所以如此严重，抗生素的滥用难辞其咎。当长期使用抗生素，破坏人体正常肠道菌群时，艰难梭菌就会乘虚而入，大量繁殖，引发伪膜性肠炎、腹泻、肠穿孔等多种疾病症状，严重时会威胁生命。

过往研究表明，艰难梭菌有5个主要的进化分支，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，其中II型分支由于其强致病性，又被称为“超毒力分支”，是近年来在北美、欧洲等地区造成数次爆发性感染的罪魁祸首。

艰难梭菌会产生三种毒素 ：毒素 A、毒素 B 和二元毒素。其中，毒素B（TcdB）是艰难梭菌致病的关键“武器”，而不同分支产生的毒素B，则又分属不同的亚型（以TcdB1、TcdB2等方式标注）。举个例子，II型“超毒力分支”产生的毒素B，标注为TcdB2。

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它从“另一扇门”入侵人体

此前，陶亮团队关于经典型的艰难梭菌毒素B在肠道上皮细胞中受体的研究工作，获得了业内广泛的关注和认可。他们已经发现了TcdB1、TcdB3、TcdB5重要的宿主细胞受体——FZD蛋白（注，FZD蛋白也是重要的WNT信号通路的受体）。可以简单理解为，他们已经破解了部分TcdB是如何通过 “大门”进入肠道上皮细胞的。

论文截图

但作为另一大“毒王”，“超毒力分支的艰难梭菌”专有表达毒素B的两种变体（亚型）——TcdB2和TcdB4，均不识别FZD蛋白。

不知道“大门”在哪里，这两种毒素变体又是如何进入细胞中的？

论文图文摘要

陶亮团队尝试敲除细胞中的FZD蛋白（经典受体），细胞依然对TcdB4高度敏感。他们猜测，一定存在“另一扇门”——即某种未知受体介导了变体的毒素B入侵细胞。

利用一种名为CRISPR/Cas9的基因敲除文库筛选技术，陶亮团队排查筛选出了一系列相关的候选因子，即“怀疑对象”。经过分析后，他们锁定了嫌疑人——一个名为组织因子途径抑制因子（TFPI）的蛋白，认为这个存在于细胞表面的蛋白“涉案”可能性最大，很可能就是这两种毒素B变体进入细胞的“另一扇门”。

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TFPI就是隐匿已久的新通道

为了验证这一猜想，研究团队思维缜密地设计并进行了各种不同类型的实验。

关键实验之一，敲除TFPI这扇“大门”，看TcdB4是否还能闯入细胞。

TFPI在哺乳动物中存在α和β两种主要的同源异构体，两种形式都具有介导TcdB4进入细胞的能力。由于TFPI全敲除会导致小鼠死亡，研究团队构建了TFPIβ敲除的小鼠。随后对小鼠进行腹腔注射TcdB4进行毒素挑战实验，发现有超过60%的纯合型（TFPIβ？/？）小鼠存活了下来。“证明TFPI是TcdB4的关键受体，并且显示了肾脏是全身系统感染下的主要受损器官”，陶亮说。

TcdB4和TFPI形成复合物的三维结构图

关键实验二，从分子水平直接“看到”毒素和受体的结合。

陶亮团队与施一公团队的李颜颜研究员等开展合作，利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术，解析了分辨率为3.1？的毒素-受体复合物（TcdB4-TFPI）的三维结构。

随后，通过对比， 研究团队对艰难梭菌毒素B进入细胞的路径进行了归类：第一类以TcdB1/3/5为代表，从FZD这扇“大门”进入；第二类主要包含“超毒力分支”的TcdB2和TcdB4，选择通过TFPI这扇“大门”进入。

(A) 毒素-受体复合物TcdB1-FZD2与TcdB4-TFPI的结构比较。(B) 系统进化分析发现TcdB基于受体结合区域差异可分为两大类，分别识别FZD和TFPI。(C) 艰难梭菌分支I、III、IV、V的TcdB识别FZD作为受体，超毒力分支II的TcdB识别TFPI作为受体。

关键实验三，构建“TFPI诱饵”诱捕毒素，看能否保护细胞和实验动物不受伤害。

研究团队构建了一种“TFPI诱饵”——即含有TFPI部分关键区域的可溶性蛋白——来迷惑并诱捕毒素分子。结果发现，无论是在细胞水平还是小鼠模型中，这类“TFPI诱饵”都可以有效阻止超毒力分支艰难梭菌的毒素B的破坏，起到了显着的保护作用。

“这不仅进一步证实了TFPI是超毒力艰难梭菌的TcdB在肠道上皮中的受体，更预示了可溶性TFPI作为中和蛋白在防治超毒力艰难梭菌感染中的潜在应用价值。”陶亮解释说。

如前文所述，艰难梭菌的特性使其在抗生素治疗时效果较差且复发严重。而基于受体的靶向开发，比如中和抗体，是一类路线不同的新策略，理论上说靶点更加精准，对人体和环境带来的负面影响也更小。

这项研究对于揭示和理解艰难梭菌感染的致病机制、及梭菌大毒素的进化和工作方式方面有着重要科学意义，并且为超毒力分支菌株引起的艰难梭菌感染的预防，以及治疗新方法的开发，提供了重要的理论依据。

原始出处：

Jian hua Luo， et al. TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile. Cell， 2022.