World J Diabetes：通心络促进内皮依赖性动脉生成减轻糖尿病周围动脉病变

背景：糖尿病是一种慢性全身性代谢性疾病，由基因决定，并与环境因素有关。糖尿病的发展通常伴随着各种急慢性并发症，其中外周动脉疾病(PAD)是最常见的血管并发症之一，也是导致足部溃疡、后肢截肢和死亡的主要原因之一。糖尿病周围动脉病变的主要病理特征是后肢动脉进行性闭塞。主要表现为间歇性跛行、足背动脉搏动减退、足部皮温降低、皮肤发紫等临床症状。目前，控制糖尿病PAD进展的基本方法是恢复后肢的血液供应。抗凝药物和血管成形术可以在一定程度上恢复血管再灌注，但这些药物的副作用和术后高复发率限制了它们的应用。

越来越多的证据表明，促进缺血的后肢血管重建，包括血管生成和动脉生成，是改善血液供应的有效途径。血管生成是微血管系统的扩张，其特征是毛细血管发芽、内皮细胞增殖和迁移以及管壁重塑。动脉生成，通常也被称为侧支血管生成或治疗性血管生成，涉及现有闭合侧支动脉的扩张、开放和重塑。作为一种毛细血管形成的方法，血管生成不足以取代狭窄或闭塞的动脉，而动脉生成对于增强血流灌注是必不可少的，并且对于挽救缺血组织至关重要。动脉形成又依赖于内皮细胞的多种功能。简而言之，内皮细胞不仅调节血管扩张和促进血管重塑，而且作为调节炎症反应的血管屏障，两者在动脉形成中都发挥着重要作用。此外，内皮细胞和平滑肌细胞之间的通讯在动脉形成过程中是必要的，因为它是穿过血管壁的侧向信号。然而，糖尿病引起的过多的活性氧(ROS)、持续的炎症和其他病理因素导致内皮细胞下垂和功能障碍，进一步加速了PAD的进展。因此，寻找更安全、更有效的治疗药物来促进内皮依赖性动脉生成，已成为降低PAD发生率、促进后肢血流恢复的当务之急。

通心络(TXL)是由12种草药组成的中药配方，其中包括以水蛭、蝎子、蜈蚣、蝉皮、地金龟为代表的5种动物制剂和以人参、芍药、香木叶、黄檀、乳香、冰片、棘枣为代表的7种植物制剂。以上12种中药经浓缩、提取、冻干、标准化制成TXL胶囊，广泛应用于临床治疗心脑血管疾病。研究证明，TXL具有抑制血栓形成、保护血管内皮细胞、促进血管舒张、促进血管生成、抑制炎症的作用。此外，研究发现TXL在糖尿病相关血管疾病的干预中发挥作用。例如，先前的研究表明，TXL通过维持内皮细胞屏障的完整性来保护糖尿病心脏免受缺血/再灌注损伤。另一项研究表明，TXL可阻止转化生长因子1 (TGF-1)从肾小球内皮细胞向肾小球类囊体细胞的转移，从而抑制糖尿病肾病[的进展。然而，有关其对糖尿病引起的后肢血管病变的疗效的科学证据尚未获得。

目的：我们的研究旨在确定TXL在糖尿病性PAD治疗中的作用，并探讨其与内皮依赖性动脉生成的相关机制。

方法：结扎db/db小鼠股动脉建立糖尿病垫动物模型。用激光多谱勒成像和微计算机断层扫描(MicroCT)评价血流恢复和动脉形成情况。采用组织病理学、Western印迹分析、酶联免疫吸附试验和实时定量聚合酶链式反应等方法评价血管内皮细胞功能与动脉形成和细胞粘连的关系。体外培养的人血管内皮细胞(HUVECs)和人血管平滑肌细胞(VSMCs)经TXL处理4h后，在高糖和低氧条件下孵育，以诱导细胞损伤。检测HUVEC下垂及功能指标、HUVECVSMC相互作用及VSMCs迁移情况。

结果：激光多谱勒成像和显微CT显示通心络可恢复后肢血流量，促进动脉生成。TXL还通过含有3/Caspase-1/GSDMD信号通路的活性氧物种/核苷酸结合的寡聚化结构域样受体家族3/Caspase-1/GSDMD抑制内皮细胞下垂。此外，TXL还恢复了内皮细胞的功能，包括维持血管扩张的平衡，作为一种屏障来减轻炎症，并通过Jagge-1/Notch-1/erigin-B2信号通路增强内皮-平滑肌细胞的相互作用。在体外也观察到了类似的结果。

表1引物序列

图1实验设计。通心络(TXL)改善小鼠后肢外观，恢复血流。A:后肢脉管系统;B:结扎部位;C:实验操作时间线;D:术后4周小鼠缺血后肢外观;E:术后每周评估小鼠肢体外观评分;F:术前、术后及术后第7、14、21、28天行激光多普勒灌注成像;G:缺血肢体组织灌注定量(红框)表示为非缺血肢体灌注的百分比。数据以均数±标准差表示。aP与模型组比较< 0.05,bP与TXL-L组比较< 0.05,n = 4 ~ 8。TXL:通心络。

图2通心络促进缺血后肢动脉生成。A:小鼠四肢微膜血管铸型的代表性全贴装图像;B和C:侧支血管用白色箭头表示，并通过显微计算机断层扫描分析量化以确定血管体积和表面积;D:免疫荧光染色CD31(红色)和α-SMA(绿色)评价缺血内收肌毛细血管密度和小动脉(200x, bar=100 μm);E-F: CD31和α-SMA的平均荧光密度定量。所有数值均以均数±标准差表示。aP与正常组比较<0.05,bP与模型组比较<0.05,cP与通心络组比较<0.05,n = 3 ~ 6。TXL:通心络。

图3通心络抑制内皮细胞焦亡。A:免疫荧光染色评价缺血后肢活性氧(ROS)水平(400×， bar = 50 μm);B: ROS平均荧光强度定量;C-G: Western blot分析缺血内收肌中焦解相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1和Cleaved Caspase-1的表达;H和I:采用ELISA法检测发热相关炎症因子IL-18和IL-1β。数值以均数±标准差表示。aP与正常组比较< 0.05,bP与模型组比较< 0.05,cP与通心络l组比较< 0.05,n = 3 ~ 4。ROS:活性氧;TXL:通心络。

结论：通心络具有促动脉生成作用，其机制可能与抑制内皮细胞下垂，恢复内皮细胞功能，促进内皮细胞-平滑肌细胞相互作用有关。

原文出处：Gu JJ,  Hou YL,  Yan YH, et al.Tongxinluo promotes endothelium-dependent arteriogenesis to attenuate diabetic peripheral arterial disease.World J Diabetes 2023 Mar 15;14(3)