ceRNA：从全新的视角研究转录组

当我们谈到基因表达，自然离不开microRNA（miRNA）。这一类小小的非编码RNA通过与mRNA目标结合，抑制其翻译成蛋白质，从而在胚胎发育、细胞分化以及器官形成等过程中发挥重要作用。然而，事情并非如此简单。单个mRNA可能受到多个miRNA的调控，而单个miRNA能够调控多个mRNA。mRNA与miRNA之间的串扰（crosstalk）是如此复杂，又如此迷人，引无数学者竞折腰。

miRNA争夺战

2011年，哈佛大学医学院的著名癌症遗传学家Pier Paolo Pandolfi教授在《Cell》杂志上提出假说，认为不同类型的RNA分子会争相与miRNA结合，从而减少miRNA对其mRNA目标的抑制作用1。

换句话说，当没有竞争性的转录本存在时，miRNA可能抑制翻译或增强mRNA的降解。当竞争性内源RNA（ceRNA）上调时，ceRNA争先恐后地与共同的miRNA结合，导致mRNA翻译的增加2。

这些竞争性内源RNA可能包括各种类型的RNA转录本，比如环状RNA（circRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、假基因以及蛋白编码mRNA。它们通过miRNA应答元件（MRE）介导的“语言”来竞争miRNA。根据假说，享有共同MRE的编码和非编码RNA转录本能够彼此积极地沟通，调节各自的表达水平。

自首次提出以来，Pier Paolo Pandolfi的假说就引起了科学界的轰动。当然，一些研究也对这一理论提出了质疑。在一篇近期发表于《Nature Review Genetics》的文章中，澳大利亚Garvan医学研究所的研究人员全面评估了支持和反对ceRNA假说的各项证据，以评估内源性miRNA海绵的影响3。

 
竞争性内源RNA的机制（图片来源：Nature Review Genetics）

分子机制

mRNA、假基因、lncRNA和circRNA都可以充当ceRNA，阻止miRNA与蛋白编码mRNA的相互作用。因此，这些ceRNA也能在ceRNA网络中彼此调节。这种串扰的强度是由多个条件决定的，包括miRNA和目标的相对水平、miRNA结合位点的数量，以及miRNA与目标或ceRNA结合的强度。

mRNA作为ceRNA。在目前验证过的ceRNA中，大多数是mRNA，它们能够竞争miRNA的结合，从而调控基因表达。对于磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN），一个推定的ceRNA是锌指E盒结合同源框2（ZEB2）mRNA。研究证明，ZEB2 mRNA能够隔离共享的miRNA而调控PTEN的表达。在人类黑色素瘤中，ZEB2表达的减弱导致抑癌基因PTEN被抑制。总之，蛋白编码转录本和编码基因的3’ UTR可能作为miRNA的内源性诱饵，从而调控miRNA的目标，发挥重要的生物活性。

lncRNA作为ceRNA。随着lncRNA的数量不断增加，越来越多的研究也开始关注lncRNA在表观遗传机制及其他生物学过程中的作用。作为天然的miRNA诱饵，lncRNA有望在转录后调控水平充当ceRNA。比如，肌肉特异的lncRNA LINCMD1通过与miR-133和miR-135结合，调节了肌肉分化。这些miRNA通常负向调节转录因子MAML1和MEF2C的表达。因此，LINCMD1作为miRNA诱饵，激活了MAML1和MEF2C。

假基因作为ceRNA。在转录组中，假基因也占了相当大的比例。测序显示，假基因内的核苷酸序列得到了很好的保留，这表明可能存在选择压力来维持这些遗传元件。假基因没有内含子，但与其祖先基因共享了5’和3’ UTR。过表达和RNAi实验证实，假基因PTENP1在转录后通过共享的miRNA调节了PTEN的表达。不过，目前只有极少数假基因经过了功能验证，还需要更多的证据来支持。

circRNA作为ceRNA。到目前为止，研究最多的circRNA是性别决定Y（SRY）基因产生的，但这些环状RNA的生物学功能还不清楚。最近，SRY被确定为miR-138的海绵，具有ceRNA活性，表明这些环状RNA可能在RNA调控网络中发挥重要作用。circRNA已在多种类型的组织中被鉴定出，它们耐受RNase R的处理，且半衰期比线性RNA转录本更长。因此，具有ceRNA活性的circRNA可能是串扰中的有效调节剂。

ceRNA与癌症

其他研究已经证明，ceRNA通过调节关键癌基因或抑癌基因的表达，在癌症发病中扮演重要的角色。

广东医学院的研究人员2015年在《Oncology Letters》上回顾了近期的研究，表明ceRNA在癌症发展中起作用4。例如，编码RNA和非编码RNA（如lncRNA和假基因转录本）都可以充当ceRNA，诱导细胞增殖失控。

CDC42是一个参与细胞周期的基因，它抑制增殖、集落形成和肿瘤生长。有人推测，CD44 mRNA和CDC42 mRNA竞相与miRNA结合。在上皮性卵巢癌中，CD44的表达上调让CDC42 mRNA从抑制中释放出来，从而导致结果向好的方向发展。与此相反，在Burkitt淋巴瘤、神经母细胞瘤和前列腺癌中，CD44表达的下降伴随着致癌转化。

同样地，HMGA2已被证明通过两种机制促进肺癌形成：作为蛋白编码基因和非编码RNA。HMGA2在转移性肺腺癌中高表达，它促进了癌症发生和转移。另外，HMGA2通过与TGF-β共受体TGFβR3争夺let-7，也促进了肺癌形成。let-7激活了参与肺癌发展的TGF-β信号通路。

此外，ceRNA也在细胞生长和增殖中发挥作用。例如，假基因PTENP1与PTEN竞争miRNA的结合，调节了特定miRNA目标的去阻遏。PTENP1的缺失使得PTEN-miRNA结合增加，降低了PTEN的翻译，从而导致肿瘤抑制功能减弱。PTENP1基因组拷贝数丢失的存在也支持了PTENP1是肿瘤抑制基因的假说。

研究工具

尽管ceRNA的研究仍处于起步阶段，但它已成为RNA生物学研究的一个新兴领域。《Nature Review Genetics》的文章中列出了一些策略，可以在整个转录组范围内研究miRNA结合的竞争。

 
ceRNA的研究策略（图片来源：Nature Review Genetics）

研究人员通常先确定研究对象：癌组织 vs 癌旁组织，用药前后或不同发育阶段的样本，然后通过芯片或新一代测序来筛选差异的miRNA、lncRNA和mRNA等。他们可以借助测序平台来开展small RNA-Seq，以测定miRNA的丰度，或利用Sensor-seq来测定miRNA的活性。他们也可以利用Affymetrix的基因芯片来开展分析。

对于miRNA表达谱分析，QIAGEN提供了一套专门设计的产品，miScript PCR System能克服与循环miRNA定量相关的挑战。同样地，human RT² lncRNA PCR Array也为循环lncRNA的定量提供了一个解决方案。

之后，研究人员可利用生物信息学方法对ceRNA调控网络进行预测。当然，验证工作也必不可少。大家可以在蛋白水平和RNA水平验证ceRNA对目的基因的影响，以及ceRNA对miRNA的依赖性，并在细胞水平和动物模型中完成功能验证。

总的来说，目前发现的ceRNA还比较少。在未来的研究中，我们一方面需要找到更多的ceRNA，另一方面需要探索ceRNA串扰是否是一个大型的RNA转录调控网络。通过ceRNA的研究，人们有望发现癌症及其他疾病的标志物，并为癌症治疗提供新的视角。

参考文献

1. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L. and Pandolfi, P.P. (2011). A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell 146,353–8.
2. de Giorgio, A., Krell, J., Harding, V., Stebbing, J. and Castellano, L. (2013) Emerging roles of competing endogenous RNAs in cancer: insights from the regulation of PTEN. Mol Cell Biol. 33, 3976–3982.
3. Thomson, D.W. and Dinger, M.E. (2016) Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy. Nat Rev Genet. 17, 272–83.
4. Dai, Q., Li, J., Zhou, K. and Liang, T. (2015) Competing endogenous RNA: A novel posttranscriptional regulatory dimension associated with the progression of cancer. Oncol Lett. 10, 2683–2690.