Genome Res：新的多重Digenome-seq工具让CRISPR-Cas9飞得更高

自从2013年1月首次用于基因组编辑以来，CRISPR-Cas9的知名度与日俱增。让它如此引人注目的原因在于它惊人的高效性和实用性；简而言之，它比较容易使用。去年，来自韩国基础科学研究所基因组工程中心的Jin-Soo Kim研究团队在Cell Stem Cell期刊上发表一篇标题为“Functional Correction of Large Factor VIII Gene Chromosomal Inversions in Hemophilia A Patient-Derived iPSCs Using CRISPR-Cas9”论文，描述了他们如何利用CRISPR-Cas9技术校正了一个倒位的基因序列，从而有效地治愈了一种血友病。该团队还利用这种技术在没有外源DNA提供模板的情形下对作物进行基因修饰。它是如此一种非常有用的工具以至于它的未来潜力非常巨大，也以至于它成为了2015年12月在美国华盛顿特区举办的人类基因编辑国际峰会的焦点。

CRISPR-Cas9是一种非常优秀的工具 ，但是这种技术也并不完美。在使用时，它有时会在未曾预料的脱靶位点上产生插入和缺失(insertions and deletions, indel)。鉴于预料之外的基因切割可能导致意想不到的突变，因此检测CRISPR-Cas9基因编辑过程中发生的任何错误是至关重要的。

如今，在一项新的研究中，Jin-Soo Kim团队提供一种被他们称作多重Digenome-seq (digested genome sequencing，即酶消化基因组测序)的工具，能够同时地绘制出几种CRISPR-Cas9核酸酶的全基因组特异性，并且能够很快地和低成本地发现想要的和不想要的indel。相关研究于2016年1月19日提前发表在Genome Research期刊上，论文标题为“Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq”。

论文第一作者Daesik Kim解释道，“Digenome-seq不同于其他的基于细胞的方法，这是因为它在体外而不是在细胞内检测不含细胞的基因组DNA上的切割位点。”利用不含细胞的DNA的优势在于它产生精确的分析结果，这是因为通常在细胞中发现的染色质不会干涉这一分析过程。再者，在研究前，待研究的DNA并不需要利用PCR进行大量扩增，因此Digenome-seq比之前的方法更加简单、快速和廉价。Digenome-seq靠将不含细胞的靶DNA与Cas9核酸酶和单向导RNA(sgRNA)在体外结合在一起而运作。sgRNA引导Cas9到DNA上的靶位点和脱靶位点上，在那里，Cas9 能够进行切割。

在这项研究中，研究人员利用多重Digenome-seq工具在体外鉴定出能被切割的靶位点和脱靶位点，从中找出上百个能够潜在导致意料之外突变的脱靶位点，并在细胞内测量了这些脱靶位点的indel发生频率。他们然后利用一种他们自己开发的被称作脱靶效应指数(off-target effect index, OTI)的体系对它们的准确性进行评分。OTI体系会比较每种sgRNA的脱靶频率(off-target frequency)与在靶频率(on-target frequency)的比值。

不同于Jin-Soo Kim团队去年发表在Nature Methods期刊上的单重Digenome-seq工具(论文标题为“Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells”)，即一次只能分析一种sgRNA，多重Digenome-seq可同时分析多种sgRNA从而能够同时检测它们的靶位点和脱靶位点。这种多重分析过程比之前的方法更加迅速、高效和节约成本。除了快速外，多重Digenome-seq也能够比诸如HTGTS或Guide-seq之类的其他方法检测出更多的脱靶位点indel。

韩国基础科学研究所主任Jin-Soo Kim说，“CRISPR-Cas9是一种惊人的科学突破，将持续成为全世界生物学家们的研究焦点。”他补充道，“这种多重Digenome-seq工具也能够被用来选择脱靶效应最小的靶位点。在CRISPR-Cas9的治疗应用时，这是一个非常重要的方法。”

鉴于超优的准确性、成本节省和检测速度，多重Digenome-seq似乎是测试CRISPR-Cas9特异性的新标准方法。