Nat Commun：山东大学王传新/杜鲁涛/李娟团队开发多重甲基化特异性定量PCR检测方法，可无创检测早期乳腺癌

肺癌曾是全球最常见的恶性肿瘤，但是2021年世界卫生组织发布最新数据显示，乳腺癌（BC）已超过肺癌成为了癌症之首，对人类健康构成严重威胁。早期诊断是延长患者生存时间和降低癌症死亡率的关键。乳腺X线检查和超声检查是临床上早期筛查乳腺癌的主要方法，但它们都存在局限性：乳腺X线检查诊断致密乳腺癌的敏感性低至30%，超声检查的诊断准确性依赖于检查设备和医生的经验，并且影像学检查假阳性率较高，容易导致过度诊断、过度治疗。

因此，为了改善疾病的诊断和预后归，临床迫切需要开发一种高灵敏度、高特异性的检测方法来对乳腺癌进行早期诊断。DNA甲基化可以在不改变DNA序列的情况下调节基因表达，在许多生物过程中发挥着重要作用，包括癌症的发生和发展，且DNA甲基化也参与人体对肿瘤的免疫反应。DNA甲基化变化几乎在所有癌症中都可以被观察到，并往往发生在癌前或早期癌症阶段。因此，DNA甲基化被认为是癌症早期诊断的一个理想标志物。

那么，从肿瘤免疫改变的角度看，外周血单核细胞（PBMC）中的DNA甲基化改变是否可以作为乳腺癌早期检测的标志物呢？

近日，山东大学第二医院王传新、杜鲁涛、李娟团队及合作者在Nature Communications发表了题为“A multiplex blood-based assay targeting DNA methylation in PBMCs enables early detection of breast cancer”的文章。研究团队将Infinium 850 K BeadChip、焦磷酸测序和靶向亚硫酸氢盐测序相结合，鉴定了四种乳腺癌特异性甲基化标志物。基于乳腺癌PBMC中的这四种甲基化标志物，研究团队开发了一种高效、便捷的多重甲基化特异性定量PCR检测方法（BC-mqmsPCR）用于检测乳腺癌，并在多中心队列中验证了其诊断性能。

文章发表在Nature Communications

该检测方法能够区分早期乳腺癌患者和正常对照，AUC为0.940，敏感性为93.2%，特异性为90.4%。与传统肿瘤标志物CA153、CA125和CEA相比，结果显示BC-mqmsPCR检测优于现有的临床诊断方法，特别是对于早期和微小肿瘤的检测。

该研究共入组了820名患者，纳入条件为：（i）病理诊断为乳腺癌（未进行手术、放化疗等任何治疗）;（ii）不存在其他癌症；（iii）没有其他已知的可能改变PBMC特性的炎症性疾病（细菌或病毒感染、哮喘、自身免疫性疾病、活动性甲状腺疾病）；（iv）受试者能够理解并签署参与研究的书面知情同意书。经过筛选，最终有781名受试者被纳入该研究。并被分为三个队列：队列I（标志物发现组）、队列II（标志物确认组）、队列III（多中心队列）。

研究中，所有甲基化检测均基于PBMC，共781个样本（366个乳腺癌、290个正常对照、125个其他肿瘤）用于DNA甲基化分析、甲基化标志物筛选和早期乳腺癌诊断方法的开发。研究设计如图1所示。

图1. 研究设计流程图。

研究团队使用Infinium Human Methylation 850 K BeadChip检测了50名乳腺癌患者和30名正常对照PBMC中的全基因组DNA甲基化状态，探索了PBMC中乳腺癌特异性的DNA甲基化标志物。经过归一化和批量校准后，鉴定出820,000个标志物用于后续分析。乳腺癌与正常对照之间存在289个差异甲基化CpG位点（DMP）（194个基因），其中112个DMP（38.8％）在肿瘤中显著高甲基化，177个DMP（61.2％）显著低甲基化（图2a）。

与正常对照组相比，乳腺癌患者的转录起始位点（TSS）是低甲基化的（图2c），这可能与乳腺癌患者的免疫激活有关。差异甲基化的基因通路分析显示，与DMP相关的基因在免疫监测和免疫编辑系统相关的通路中富集（图2d）。可见，乳腺癌患者PBMC中DNA甲基化变化与宿主免疫反应相关。

图2. Infinium 850K微阵列观察到的PBMC中乳腺癌相关DNA甲基化特征 。

接下来，研究团队应用一系列筛选原则鉴定了乳腺癌最重要和最特异的DNA甲基化标志物。在200名患者的队列中，使用焦磷酸测序和亚硫酸氢盐靶向测序（TBS）评估了8种标志物的可重复性。结果显示，乳腺癌和正常对照组之间的4个低甲基化标志物没有显著差异；在焦磷酸测序和TBS中，与正常对照组相比，其他4种高甲基化标志物在乳腺癌患者中表现出更高的甲基化水平且比较稳定（图3b）。

为了表征所鉴定出甲基化标志物在检测早期乳腺癌和小型乳腺癌肿瘤中的潜力，研究团队建立了受试者操作特征（ROC）曲线。正如预期，每个甲基化标志物都可以区分早期乳腺癌和小肿瘤（≤1.5 cm）（图3d）。这4个标志物的无监督分级聚类能够以中等的特异性和敏感性将乳腺癌与正常对照区分开来（图3e）。

图3. 乳腺癌相关DNA甲基化标志物的鉴定与验证。

如何在临床中快速、经济、高效、方便地检测这些标志物呢？基于这四种甲基化标志物，研究团队开发了一种高效、便捷的多重甲基化特异性定量PCR检测方法BC-mqmsPCR，可以在单个反应中同时多重定量四个甲基化标志物，用于检测乳腺癌。

基于同一病例的亚硫酸氢盐转化的PBMC DNA，研究团队将4重标志物BC-mqmsPCR检测与单个标志物qMSP检测进行了比较，证实了多重检测可以实现荧光信号积累，并且分析上比单独检测更灵敏，BC-mqmsPCR能够区分乳腺癌和其他非乳腺癌患者，AUC为91.3%（图4）。

图4. BC-mqmsPCR在乳腺癌诊断中的开发与应用。

乳腺癌的早期诊断是降低患者死亡率的关键。考虑到单个标志物已经在微小肿瘤和早期乳腺癌中显示出良好的诊断价值，研究人员进一步评估了BC-mqmsPCR在早期乳腺癌中的表现。如图5所示，0/I期和II期乳腺癌患者的甲基化水平显著高于III期患者，并且BC-mqmsPCR对训练和验证集均显示较高的AUC（0.940和0.927）和敏感性（93.3%和85.7%）。对于≤1.5厘米的肿瘤，BC-mqmsPCR在训练集和验证集中的AUC分别为0.945和0.936，灵敏度分别为93.2和90.0%。

图5. BC-mqmsPCR在微小肿瘤和早期乳腺癌检测中的应用。

此外，研究团队比较了BC-mqmsPCR与临床上在使用的肿瘤标志物CA153、CEA和CA125。结果显示，BC-mqmsPCR的检出率为82.0%，明显高于CA153的5.3%、CEA的6.0%和CA125的3.5%。此外，对于≤1.5厘米的肿瘤，CA153和CEA未检出，CA125只检出其中的2.1%，BC-mqmsPCR则检出了91.7%。

综上所述，研究团队开发了一种基于PBMC四种DNA甲基化标志物的简单有效的检测方法BC-mqmsPCR，可以用于快速、无创地诊断乳腺癌。该方法具有较高的灵敏度和特异性，尤其适用于早期乳腺癌和微小肿瘤的检测。此外，与现有的临床程序相比，BC-mqmsPCR可以更早地识别肿瘤，显示出进一步改善乳腺癌早期诊断和患者预后的潜力。

参考资料：

Wang, T., Li, P., Qi, Q. et al. A multiplex blood-based assay targeting DNA methylation in PBMCs enables early detection of breast cancer. Nat Commun 14, 4724 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40389-5