钙网蛋白(calreticulin)与肿瘤免疫的研究

存的场所，各种内外源性损伤均可导致内质网折叠功能紊乱，引起内质网应激。许多肿瘤都可以观察到内质网应激。在内质网应激情况下，内质网分子伴侣糖调节蛋白GRP78 与重链结合蛋白Bip 表达水平上调，通过多种机制使肿瘤生长，与肿瘤的演进、耐药性甚至转移有关[1] ；而新近研究发现，内质网钙结合蛋白钙网蛋白(calreticulin，CRT) 在内质网应激情况下，能诱导免疫原性细胞凋亡，引发肿瘤免疫[2]。本文就钙网蛋白在肿瘤免疫中的作用作一综述。

1　钙网蛋白的结构和功能

人类钙网蛋白基因位于第19 号染色体(p13.2-p13.3)，由9 个外显子和8 个内含子构成，其开放性阅读框架长度为1254 bp，编码由417 个氨基酸组成的酸性蛋白质(pI= 4.7)。目前发现钙网蛋白存在于除酵母外的所有细胞中。钙网蛋白由如下三个结构和功能区域组成：N 区(aa1-180) 由反向平行的β- 折叠和螺旋- 转折- 螺旋组成球形三维结构，该区域是钙网蛋白与重金属(Zn2+) 结合的区域( 图1)[3]。在体外这个区域还可以和其它内质网分子伴侣、细胞核受体的DNA 结合域和核酸相互作用。钙网蛋白N 区的另一个重要功能，是与P 区一起维持其分子伴侣的功能。P 区(aa181-290) 是一个富含脯氨酸的区域，形成一展开式的手臂结构，它能与内质网腔的其他分子伴侣相互作用。C 末端区(aa291-400) 带有高密度的负电荷，可高容量结合Ca2+，参与Ca2+ 在内质网的储存。在钙网蛋白的C末端存在KDEL 内质网滞留信号，该信号与钙网蛋白在内质网中滞留密切相关[3-5]。

2　钙网蛋白与肿瘤免疫

2.1　钙网蛋白与免疫原性细胞凋亡

2007 年Obeid 等[2] 发现，用20 种不同的化疗药物处理小鼠大肠癌细胞CT26，均可诱导CT26发生凋亡，他们将这些凋亡的肿瘤细胞作为免疫原细胞接种到小鼠的一侧下肢，8 天后再在小鼠另一侧下肢接种同种肿瘤活细胞，结果发现蒽环类化疗药物处理的肿瘤细胞能在动物体内诱导出杀伤同种肿瘤细胞的免疫效应，而其它的化疗药处理的细胞则无此功能。进一步研究发现，上述药物中，仅蒽环类药物能使钙网蛋白从肿瘤细胞内转位到细胞膜上并发生簇集。这些膜上富集钙网蛋白的凋亡肿瘤细胞可被动物体内的树突状免疫细胞(DC 细胞) 识别和吞噬，DC 细胞在消化被吞噬的肿瘤细胞的同时，对肿瘤相关抗原进行加工和提呈, 由此激发机体的特异性抗肿瘤免疫应答。如用特异性的抗体阻断凋亡细胞膜上的钙网蛋白可抑制DC 细胞对它的吞噬。将肿瘤细胞中的钙网蛋白基因敲除，再用蒽环类药物使该细胞凋亡，结果这种凋亡的肿瘤细胞同样失去了被DC 细胞吞噬的能力。上述研究提示，凋亡肿瘤细胞膜上大量出现钙网蛋白是介导特异性抗肿瘤免疫的关键性因素。随后研究进一步发现，除蒽环类化疗药外，γ- 射线、紫外线和奥沙利铂等药物亦可诱导钙网蛋白发生膜转位[6-9]。

2.2　钙网蛋白的转位机制

钙网蛋白转位的机制至今尚未完全阐明[10]。2009 年Panaretakis 等[11] 研究发现，免疫原性的细胞死亡需要内质网应激分子的参与。凋亡刺激信号首先激活内质网中的应激激酶PERK， 活化的PERK 导致翻译起始因子eIF2α 发生磷酸化，继而激活caspase-8，活化的caspase-8 介导内质网蛋白BAP31( 一种能与BCl-2 家族结合的蛋白) 裂解，由此引起Bax 和Bak 的构象性活化，活化的Bax 和Bak 促使CRT 从ER 顺势转入高尔基体，最后通过SNARE( 一种膜性泡融合必须的蛋白质) 依赖的胞吐作用转位到细胞膜上。如用eIF2α 突变基因( 该突变体不能被磷酸化) 或BAP31 突变基因( 该突变体不能被裂解) 取代小鼠体内相应的正常基因，蒽环类化疗药等刺激将不再能导致CRT 发生转位。PERK、Bax、Bak 或SNARE 基因缺失能产生相同的效应[11,12]。Zitvogel 等[13] 和Lu 等[14] 的研究亦证实了这一现象。Tarr 等[15] 的研究提出了另一种CRT 膜转移的机制。他们发现，在凋亡应激条件下，CRT 的胞浆浓度上升，并通过钙离子与细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS) 结合。PS 的分布受氨基磷酸脂转位酶(APLT) 的调节，它将PS 维持于细胞膜的胞浆面。凋亡过程中，在CRT 升高的同时，NO 浓度也显著性上升，而APLT 对氧化还原修饰敏感，其巯基可被活性氮自由基修饰而丧失活性，APLT 的失活将导致PS 重新分布，部分PS 从胞浆面外翻到细胞膜外侧面，从而将与其结合的CRT 带到细胞膜的表面。当用S- 亚硝基-L- 半胱氨酸- 乙基酯(APLT 抑制剂，能在胞内代谢产生NO) 处理细胞后，PS 和CRT 同时外翻，而且，CRT 和PS 在细胞膜表面重新定位并呈点状簇集。

2.3　钙网蛋白转位的影响因素

2.3.1　ERP57

已知胞内的CRT 能与内质网的压力蛋白ERP57相互作用[16-18]。2008 年，Panaretakis 等[19] 发现，蒽环类药物诱导的凋亡除了会引起CRT 在细胞膜的暴露， 与CRT 共转移的还有另一内质网蛋白ERP57( 二硫化物异构酶)。敲除ERP57 基因会抑制蒽环类药物诱导的CRT 转位，而敲除CRT 则可抑制蒽环类药物诱导的ERP57 转位。将正常CRT基因转入crt-/- 细胞内可恢复蒽环类药物诱导的ERP57 转位，但转入突变CRT 基因则无此功能。这表明CRT 与ERP57 的相互作用为二者共转移到细胞表面所必需。用逆转录病毒将特异性ERP57反义RNA 转入肿瘤细胞内，可形成ERP57 低表达的肿瘤细胞。ERP57 低表达的肿瘤细胞用蒽环类药物处理只表现为正常的凋亡，但不能引起CRT 的转位，这种细胞也不能在动物体内诱发抗同种肿瘤的免疫反应。但ERP57 低表达的肿瘤细胞人工包被重组CRT 后，可恢复其激发抗肿瘤免疫的能力。Obeid 等[20] 研究也证实CRT 的转位受ERP57转位的控制。他们发现，CRT 与ERP57 以分子复合物的形式共转位。敲除ERP57 除了抑制CRT 转位外，还抑制树突状细胞对凋亡肿瘤细胞的吞噬。敲除CRT 可抑制ERP57 的膜转移， 但用重组ERP57 包被这种细胞并不能恢复其免疫原性。由此可见，ERP57 通过协助CRT 的转位参与蒽环类药物诱导的肿瘤细胞免疫原性凋亡。

2.3.2　PP1/ GADD34

Obeid 等[2] 研究发现，蒽环类抗生素诱导的CRT 外翻发生在给药1 小时内，所以蒽环类抗生素引起的效应不是通过具遗传毒性的压力所介导。无核细胞经米托蒽醌处理后CRT 很容易发生外翻，且和完整细胞一样，可被DC 吞噬。这表明胞质内存在蒽环类抗生素作用的靶点。蒽环类抗生素可以快速引起内质网中eIF2α 的磷酸化，且该磷酸化过程与CRT 外翻密切相关。eIF2α 磷酸酶能引起eIF2α 脱磷酸化，它由两个亚单位组成，一个是催化亚单位PP1，一个是调节亚单位GADD34。单纯敲除GADD34 或PP1 均可有效诱导CRT 外翻，且这种外翻效应不能被米托蒽醌进一步提高。CRT 的外翻还可被PP1/GADD34 抑制剂泰托霉素、花萼海绵诱癌素A.salubrinal 有效诱导。蒽环类抗生素和PP1/ GADD34 抑制剂引发的CRT 外翻不受转录、翻译、微管聚合抑制剂影响，但可被肌动蛋白聚合抑制剂拉春库林A 所抑制。上述结果提示，PP1/GADD34 抑制剂能通过增加eIF2α 的磷酸化水平而引发CRT 的外翻, 从而使细胞产生抗肿瘤免疫源性。2009 年，Obeid[21] 进一步设计了一系列针对PP1/ GADD34 复合物的靶向嵌合体抑制多肽, 发现这些抑制多肽可在多种细胞株中通过抑制PP1 和GADD34 的相互作用, 诱导CRT 及ERP57 发生膜转位。这些多肽能有效提高前凋亡肽和化疗的抗肿瘤活性。Kepp 等[22] 研究也发现，GADD34(growtharrest and DNA damage-induced protein) 来源的多肽可破坏PP1 和GADD34 的相互作用， 引起eIF2α的磷酸化，从而导致CRT 的外翻。能诱导CRT 转位到细胞膜上的的蒽环类抗生素可引起PP1/GADD34 复合物的解离。上述研究表明，PP1/GADD34 复合物在调节CRT 外翻的过程中发挥着重要作用。

2.4　钙网蛋白与抗原呈递细胞

不管CRT 通过何种方式发生转位，在免疫原性的细胞凋亡时，CRT 在细胞膜上大量出现的事实是肯定的。那转位到膜上的CRT 又通过何种方式与抗原呈递细胞相互作用呢？

Gardai 等[23] 研究发现，用抗CRT 的抗体处理凋亡的成纤维细胞、中性粒细胞或T 淋巴细胞，可抑制它们被吞噬细胞识别和吞噬。有CRT 基因缺陷的小鼠胚胎纤维母细胞(MEF) 在发生凋亡后，既不能被专职吞噬细胞( 巨噬细胞) 也不能被非专职吞噬细胞( 成纤维细胞) 所吞噬，但将外源性CRT与上述凋亡的CRT-/-MEF 细胞共孵育使细胞膜包被上大量CRT 后，这些细胞恢复了被鼠腹腔巨噬细胞、人单核细胞来源的巨噬细胞及非专职吞噬细胞识别和吞噬的能力。对小鼠胚胎的组织化学分析发现，在野生型和杂合子胚胎中，凋亡细胞主要存在于吞噬细胞内，而CRT-/- 纯合子胚胎的凋亡细胞更多地以未被吞噬的状态游离存在。上述研究均提示CRT在凋亡细胞识别和吞噬中具有重要作用。

那CRT 通过何种途径被吞噬细胞识别呢？已知凋亡细胞表面的CRT 能与吞噬细胞膜上的LDL受体相关蛋白(LRP) 结合并形成复合物[24]。且这种结合将导致吞噬细胞活化。Gardai SJ 等的研究表明，抗LPR 的抗体能封闭CRT 对吞噬细胞的活化作用，而仅针对LRP 受体蛋白细胞内功能区的抗体则无此作用。这表明CRT 与LRP 的结合是CRT 活化吞噬细胞内的关键步骤。

Obeid[2] 进一步研究发现，蒽环类抗生素处理的肿瘤细胞能迅速被树突状淋巴细胞(DC 细胞) 所吞噬。如在用米托蒽醌处理肿瘤细胞的同时，还用特异性抗体封闭细胞膜表面的CRT，则能阻止DC对肿瘤细胞的吞噬。此外，用特异性SiRNA 抑制CRT 表达，同样能抑制DC 对蒽环类抗生素处理的肿瘤细胞的吞噬。DC 细胞上能识别CRT 的受体除LRP 外，可能还有清道夫受体、CD40 配体、TRAIL或Fas 配体等。所有这些配受体都可能与CRT 相互作用，介导DC 细胞识别膜上表达CRT 的细胞[25-26]。

2.5　钙网蛋白抗肿瘤免疫的机制

CRT 介导抗肿瘤免疫的机制尚未完全阐明。Obeid 证实重组CRT(rCRT) 在体外单独使用不能促进DC 的成熟[2]，Bak 等[27] 的研究发现由小鼠MEF 细胞分泌的无内质网滞留信号KDEL 序列的CRT 在体外也不能诱导DC 细胞的活化。但CRT具有佐剂的性能，Gao 等[28] 的研究指出，原核表达的CRT 能与细胞膜上的多糖分子结合，这种结合可促进B 细胞活化与成熟，在没有T 细胞的协助下使B 细胞发生Ig 合成类型转换。与多糖结合的CRT 和作为融合蛋白一部分的CRT 均呈现出很强的抗原提呈效应，能大幅提高与之结合的多糖以及蛋白的抗原性，导致相应抗体产生。也有研究者将CRT 与肿瘤抗原嵌合在一起，比单纯的肿瘤抗原免疫原性更强[29-32]。CRT 也是一种分子伴侣，它能与未糖基化的多肽结合。Basu[33] 等发现，从肿瘤中纯化的CRT 能激发机体的抗肿瘤免疫应答，其可能的机制是CRT 分子中结合有肿瘤的抗原多肽[34]，CRT 在外翻到细胞膜的过程中，同时将与之结合的肿瘤抗原肽带到细胞膜上并呈递给抗原呈递细胞，从而激发机体的抗肿瘤免疫效应。

3　结语

蒽环类化疗药物、紫外线和γ- 射线在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，还引起内质网中的CRT 快速外翻到细胞膜上，这种凋亡细胞在体内可被免疫细胞识别和吞噬，由此激发机体产生抗同种肿瘤的免疫效应。但CRT 介导抗肿瘤免疫发生的确切机制尚未完全阐明，有待进一步探讨。此外，对于在药物和射线作用下，CRT 不能转位的肿瘤细胞，是否可以通过人工干预使其细胞膜上表达大量CRT 从而获得免疫原性也值得深入研究。

参　考　文　献

[1] Ni M, Lee AS. ER chaperones in mammalian developmentand human diseases. FEBS Lett, 2007, 581(19):3641-51
[2] Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F, et al. Calreticulinexposure dictates the immunogenicity of cancer cell death.Nat Med, 2007, 13(1): 54-61
[3] Gelebart P, Opas M, Michalak M. Calreticulin, a Ca2+-binding chaperone of the endoplasmic reticulum. Int JBiochem Cell Biol, 2005, 37(2):260-6
[4] Michalak M, Corbett EF, Mesaeli N, et al. Calreticulin:One protein, one gene, many functions. Biochem J, 1999,344:281-92
[5] Chouquet A, Païdassi H, Ling WL, et al. X-ray structureof the human calreticulin globular domain reveals aPeptide-binding area and suggests a multi-molecularmechanism. PLoS One, 2011, 6(3): e17886
[6] Obeid M, Panaretakis T, Joza N, et al. Calreticulinexposure is required for the immunogenicity of c-irradiationand UVC light-induced apoptosis. Cell Death Differ,2007, 14(10):1848-50
[7] Perez CA, Fu A, Onishko H, et al. Radiation induces anantitumour immune response to mouse melanoma. Int JRadiat Biol, 2009, 85(12):1126-36
[8] Cao C, Han Y, Ren Y, et al. Mitoxantrone-mediatedapoptotic B16-F1 cells induce specific anti-tumor immuneresponse, Cell Mol Immunol, 2009, 6(6):469-75
[9] Tesniere A, Schlemmer F, Boige V, et al. Immunogenicdeath of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene,2010, 29(4):482-91
[10] Obeid M, Panaretakis T, Tesniere A, et al. Leveraging theimmune system during chemotherapy: moving calreticulinto the cell surface converts apoptotic death from silent” toimmunogenic. Cancer Res, 2007, 67(17):7941-44
[11] Panaretakis T, Kepp O, Brockmeier U, et al. Mechanismsof pre-apoptotic calreticulin exposure in immunogenic celldeath. EMBO J, 2009, 28(5):578-90
[12] Martins I, Kepp O, Galluzzi L, et al. Surface-exposedcalreticulin in the interaction between dying cells andphagocytes. Ann N Y Acad Sci, 2010, 1209:77-82
[13] Zitvogel L, Kepp O, Senovilla L, et al. Immunogenictumor cell death for optimal anticancer therapy: thecalreticulin exposure pathway. Clin Cancer Res, 2010,16(12):3100-4
[14] Lu Q, Jankowich M, Newton J, et al. Alterations inmolecular chaperones and eIF2alpha during lungendothelial cell apoptosis. Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol，2010, 298(4):501-8
[15] Tarr JM, Young PJ, Morse R, et al. A mechanism ofrelease of calreticulin from cells during apoptosis, 2010,401(5):799-812
[16] Frickel EM, Riek R, Jelesarov I, et al. TROSY-NMRreveals interaction between ERp57 and the tip of thecalreticulin P-domain. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(4):1954-9
[17] Harris MR, Lybarger L, Yu YY, Association of ERp57with mouse MHC class I molecules is tapasin dependentand mimics that of calreticulin and not calnexin. JImmunol, 2001, 166(11):6686-92
[18] Kimura T, Imaishi K, Hagiwara Y. ERp57 bindscompetitively to protein disulfide isomerase andcalreticulin. Biochem Biophys Res Commun, 2005,331(1):224-30
[19] Panaretakis T, Joza N, Modjtahedi N , et al. The cotranslocationof ERp57 and calreticulin determines theimmunogenicity of cell death. Cell Death Differ, 2008,15(9):1499-509
[20] Obeid M. ERP57 membrane translocation dictates theimmunogenicity of tumor cell death by controlling themembrane translocation of calreticulin. Immunol, 2008,181(4): 2533-43
[21] Obeid M. Anticancer activity of targeted proapoptoticpeptides and chemotherapy is highly improved by targetedcell surface calreticulin–inducer peptides. Mol CancerTher, 2009, 8(9):2693-707
[22] Kepp O, Galluzzi L, Giordanetto F, et al. Disrupt ion ofthe PP1/ GADD34 complex induces calreticulin exposure.Cell Cycle, 2009, 8( 23): 3971-7
[23] Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC et al. Cell-surfacecalreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cellsthrough trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell,2005, 123(2):321-34
[24] Orr AW, Pedraza CE, Pallero MA, et al. Low densitylipoprotein receptor-related protein is a calreticulincoreceptor that signals focal adhesion disassembly. J CellBiol, 2003,161(6):1179-89
[25] Berwin B, Delneste Y, Lovingood RV, et al. SREC-I, atype B scavenger receptor, is an endocytic receptor forcalreticulin. J Biol Chem, 2004, 279(49):51250-7
[26] Duus K, Pagh RT, Holmskov U, et al. Interaction ofcalreticulin with CD40 ligand, TRAIL and Fas ligand.Scand J Immunol 2007, 66950:501-7
[27] Bak SP, Amiel E, Walters JJ, et al. Calreticulin requires anancillary adjuvant for the induction of efficient cytotoxicT cell responses. Mol Immunol, 2008, 45(5):1414-23
[28] Hong C, Qiu X, Li Y, et al. Functional analysis ofrecombinant calreticulin fragment 39-272: implicationsfor immunobiological activities of calreticulin in healthand disease. J Immunol, 2010, 185(8):4561-9
[29] Hsieh CJ, Kim TW, Hung CF, et al. Enhancement ofvaccinia vaccine potency by linkage of tumor antigen geneto gene encoding calreticulin. Vaccine, 2004, 22(29-30):3993-4001
[30] Cheng WF, Lee CN, Su YN, et al. Sindbis virus replicationparticles encoding calreticulin linked to a tumor antigengenerate long-term tumor-specific immunity. Cancer GeneTher, 2006 13(9):873-85
[31] Chuang CM, Monie A, Hung CF, et al. Treatment withimiquimod enhances antitumor immunity induced bytherapeutic HPV DNA vaccination. J Biomed Sci， 2010,28:17-32
[32] Basu S, Srivastava PK. Calreticulin, a peptide-bindingchaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumorandpeptide-specific immunity. J Exp Med, 1999,189(5):797-802
[33] Basu S, Binder RJ, Suto R, et al. Necrotic but notapoptotic cell death releases heat shock proteins, whichdeliver a partial maturation signal to dendritic cells andactivate the NF-kappa B pathway. Int Immunol, 2000,12(11):1539-46
[34] Tamura Y, Hirohashi Y, Kutomi G, et al. Tumor-producedsecreted form of binding of immunoglobulin protein elicitsantigen-specific tumor immunity. J Immunol, 2011,186(7):4325-30

免费全文下载: 下载(PDF文件)