JMC：金坚教授团队发现首个靶向AKT变构位点的PROTAC

AKT是癌症治疗的一个重要靶点。近年来，在开发ATP竞争性的活性位点和变构位点的AKT抑制剂方面取得了重大进展，多款AKT小分子抑制剂获批临床。此外，研究人员也开发了多种基于AKT活性位点的PROTAC，包括MS21。MS21可以有效诱导PI3K/pten通路突变的肿瘤细胞中AKT的降解，并有效抑制肿瘤细胞增殖生长，但在KRAS/BRAF突变细胞中却显得束手无策，无法降解AKT蛋白。

近日，西奈山伊坎医学院金坚教授团队和Ramon E. Parsons团队在知名药物化学期刊JMC上发表题为“Novel Allosteric Inhibitor-Derived AKT Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) Enable Potent and Selective AKT Degradation in KRAS/BRAF Mutant Cells”的文章。

作者开发了首个基于变构位点的新型AKT  PROTAC 62，并且化合物62在KRAS/BRAF突变的癌细胞以及PI3k/pten突变的癌细胞中均显示出强效的AKT降解活性和抗增殖活性。此外，62在通过腹腔内给药的小鼠体内表现出良好的生物利用度和PK性质。

1、AKT靶点介绍

AKT（蛋白激酶b）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于丝氨酸蛋白激酶家族。AKT作为人类癌症中最常见的PI3K/AKT/m-TOR信号级联的中心节点，在调节癌症特征中发挥关键作用，如细胞增殖、代谢、转移、侵袭性和肿瘤细胞的存活（图1）。

AKT由三个高度同源的亚型组成，AKT1/2/3，它们都有三个进化上保守的结构域：一个N端PH结构域，一个中心激酶催化结构域和一个C端调控结构域。研究表明，AKT的过度活化和过表达与许多总体预后较差的人类癌症有关。

图1.AKT介导的信号通路

2、AKT小分子抑制剂研究进展

AKT是一种极具临床潜力的药物靶点。在过去数十年来，基于AKT领域的药物研发已经取得了积极的研究成果，多款AKT小分子抑制剂相继获批临床，包括靶向AKT活性位点的小分子抑制剂：GSK690693、GDC-0068、AZD5363和靶向AKT变构位点的抑制剂：MK-2206、ARQ-092、TAS-117。进展最快的是罗氏的GDC-0068和阿斯利康的AZD5363，目前均处于临床三期。

然而，基于活性位点的AKT抑制剂具有严重的副作用，包括高血糖、血小板减少和感染，而AKT变构抑制剂在人体临床试验中也表现出有限的疗效。

图2.进入临床试验的AKT小分子抑制剂

3、已报道的基于活性位点抑制剂的AKT PROTAC

基于靶向蛋白水解嵌合体PROTAC或分子胶的靶向蛋白降解技术（TPD）是一种通过降解致病靶蛋白来治疗疾病的治疗策略。通常，由PROTAC或分子胶诱导的泛素−蛋白酶体系统（UPS）介导的降解可以同时靶向癌蛋白的催化和非催化结构域，这可能产生比小分子激酶抑制剂更大的疗效。

近年来，研究人员已经开发了多种靶向活性位点的AKT PROTAC（图3），其中，MS21是已报道最有效的AKT降解剂，然而MS21不能有效诱导携带KRAS或BRAF突变的癌细胞中AKT的降解。为了克服MS21等靶向活性位点PROTAC在携带KRAS/BRAF突变的癌细胞较差的降解AKT能力。作者另辟蹊径，试图从AKT的变构抑制剂切入，开发新型的靶向变构位点的AKT降解剂。

图3.已报道的靶向活性位点的AKT PROTAC

下面让我们一起走进这篇文献：

1. 基于ARQ-092 PROTAC的设计思路及合成

研究表明，与ATP竞争性结合的AKT活性位点抑制剂优先结合激活的AKT（磷酸化的AKT，p-AKT）。由于在KRAS/BRAF突变的肿瘤细胞系中，磷酸化AKT蛋白水平较低，这就影响了与ATP竞争性结合的活性位点抑制剂的效果，从而导致耐药。

与靶向活性位点抑制剂不同，AKT变构抑制剂可以结合并稳定AKT的失活形式。因此，靶向AKT变构位点的PROTAC有可能在含有KRAS/BRAF突变的癌细胞中参与结合失活的AKT，这就可能诱导MS21耐药肿瘤细胞系中AKT的降解。

首先，作者选取了AKT变构抑制剂ARQ-092作为AKT PROTAC的靶头化合物，随后通过对ARQ-092与AKT1的晶体复合物进行分析，作者发现ARQ-092中的左侧苯环伸向溶剂区（图4）。因此，作者选用该位点作为连接位点进行衍生化，分别合成了末端是羧基和氨基的化合物1（末端羧基）和2（末端氨基）。随后，作者基于化合物1和2开展PROTAC合成工作。

图4. ARQ-092与AKT1的晶体复合物及化合物1和2的化学结构

VHL配体VHL-1和CRBN配体泊马度胺是最常用的两种E3泛素连接酶配体。作者同时采用这两种E3配体，分别合成了基于VHL配体和CRBN配体两种类型的AKT PROTAC。

最先开展的是基于化合物1（末端羧基）的PROTAC合成（图5）。其中，化合物3-20是基于VHL配体的PROTAC，作者分别合成了不同长度的聚乙二醇和烷烃链两种类型PROTAC。同时作者也合成了基于泊马度胺的PROTAC 21-32，同样采用了不同长度的聚乙二醇和烷烃链两种连接链类型。

图5.基于化合物1的AKT PROTAC

接下来，作者合成了基于化合物2（末端氨基）PROTAC 33-61（图6）。其中，化合物33-49是基于VHL配体的PROTAC，化合物50-61是基于泊马度胺的PROTAC。并且作者同样也考察了不同长度的聚乙二醇和烷烃链的连接链类型，其中化合物33-41和57-61是聚乙二醇类型的PROTAC，化合物42-49和50-56是烷烃链类型的PROTAC。

图6.基于化合物2的AKT PROTAC

2. PROTAC蛋白降解能力初筛实验

接下来，作者在PC3细胞系（人前列腺癌细胞）上筛选合成的PROTAC 3-61对AKT蛋白的降解能力（图7）。蛋白降解实验表明基于VHL配体的PROTAC比基于泊马度胺的PROTAC具有更强的降解能力，且烷烃链比聚乙二醇链更有效。作者从构效关系研究发现了PROTAC 20、48和49具有较强的AKT降解能力，并可以有效抑制下游信号传导，如：p-akt、p-pras40和p-s6。

图7. 化合物3-61的蛋白降解实验

3. 基于最优化合物20的进一步结构优化及后续生物活性研究

有研究表明，VHL-2（VHL-1中苄位甲基取代的结构）对VHL具有更高的亲和力。因此，作者选用了降解活性最好的PROTAC 20进行进一步结构改造，将20中的VHL-1替换成具有更高亲和力的VHL-2，得到了PROTAC 62。作者也分别合成了化合物63和64作为阴性对照化合物（图8）。

图8. PROTAC 62及阴性对照63和64的化学结构

首先，作者分别测试了PROTAC 62、63、64及靶头化合物ARQ-092对AKT三种不同亚型（AKT1、AKT2、AKT3）的酶抑制活性（图9）。实验结果显示，相较于靶头化合物ARQ-092，PROTAC表现出减弱的抑制活性，但对于AKT1/2/3都具有抑制活性。

图9. PROTAC 62、63、64及ARQ-092的酶活测试

接下来，作者测试了PROTAC 62、63、64在MS21（已报道的降解活性最好的靶向活性位点PROTAC）耐药且KRAS突变的结直肠癌细胞系SW620的降解活性（图10）。实验结果表明，化合物62能够呈现浓度依赖方式有效诱导SW620中的AKT降解，且DC50为23±16 nM，而阴性对照63和64无降解活性。

图10.化合物62在sw620中的降解实验

随后，作者比较了62和MS21在其他几种携带KRAS或BRAF突变的癌细胞类型中的AKT降解效应（图11）。蛋白质印迹实验发现，化合物62可以有效诱导各种KRAS或BRAF突变的癌细胞中AKT的降解，而MS21表现出较差的AKT降解能力。

图11. 62和MS21在各种携带KRAS或BRAF突变的癌细胞蛋白降解实验

作者继续在SW620细胞系进行了蛋白降解机制研究（图12），实验结果表明化合物62可以以时间依赖的方式诱导AKT降解，并可以有效抑制磷酸化PRAS40蛋白水平。当加入NAE抑制剂MLN4924或蛋白酶体抑制剂MG132后，可以有效逆转AKT的降解效果。基于上述实验结果，作者认为化合物62诱导AKT蛋白的降解效果依赖于泛素蛋白酶体途径。

图12. 蛋白降解机制研究实验

为了探究PROTAC 62蛋白质组范围内的降解选择性，作者对化合物62进行了基于全局串联质谱标签TMT定量蛋白分析的蛋白质组学研究，实验结果表明化合物62不能降解其他靶点蛋白，具有较好的靶点选择性（图13）。

图13.化合物62的蛋白质组学研究

接下来，作者在SW620细胞系上测试了化合物62、靶头化合物ARQ-092、阴性对照64及降解剂MS21的抗增殖活性（图14）。从细胞集落形成实验可以看出，化合物62对SW620抑制活性与ARQ-092相当，而阴性对照化合物64和MS21表现出较弱抑制活性。

图14. 化合物62、64、ARQ-092、MS21的细胞集落形成实验

最后，作者对化合物62进行了PK研究（图14），评估化合物62在小鼠体内的生物利用度。实验结果发现在给药后0.5 h可达到最大血药浓度（Cmax = 1 μM），血药浓度保持在100 nM以上至少可维持12小时。这些结果表明，化合物62表现出较好的PK性质，在体内可以获得足够的血浆暴露。

图14. 化合物62在小鼠血浆浓度测试

总结

金坚课题组报道了首个靶向变构位点的AKT PROTAC 62，PRORAC 62能够有效诱导KRAS/BRAF突变肿瘤细胞的AKT降解，这可能为靶向活性位点的MS21耐药KRAS/BRAF突变癌症提供一个潜在的策略。同时，化合物62表现出较强的降解活性、较好的靶点选择性以及较好的PK性质，这是靶向AKT PROTAC领域的一大步，也是靶向AKT领域的药物研发的一大步。

西奈山伊坎医学院金坚教授团队长期深耕于靶向蛋白降解领域，致力于蛋白降解药物的设计与开发，以及推进这些技术的临床应用与转化。该团队已经成功开发了多种靶点的PROTAC，克服了传统小分子药物的种种缺陷，为靶向蛋白降解领域的研发不断注入强心剂。包括：组蛋白甲基转移酶NSD家族NSD2/3，激酶家族AKT和ALK，EGFR以及表观遗传家族靶点EZH2等。

此外，金坚教授团队也开发了其他新型PROTAC技术：

1、叶酸包裹的Folate-Caged PROTACs，该类PROTAC进一步提高了PROTAC的细胞选择性。

2、基于寡核苷酸链的TF-PROTACs，成功实现了对不可成药转录因子的降解。

3、光诱导PROTACopto-PROTAC，实现了PROTAC的可控激活。

4、靶向WDR5 和Ikaros的双靶点PROTAC

5、开发新型的E3连接酶KEAP1配体，并成功用于BRD3/4的降解。进一步拓展了靶向蛋白质降解的有限工具箱。

参考文献

1、Novel Allosteric Inhibitor-Derived AKT Proteolysis TargetingChimeras (PROTACs) Enable Potent and Selective AKT Degradation in KRAS/BRAF Mutant Cells.J Med Chem (IF: 7.45; Q1) . 2022 Oct 27;65(20):14237-14260.

2、Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery. Nat. Rev. Drug Discovery 2005, 4 (12), 988−1004.

3、Harnessing the E3 Ligase KEAP1 for Targeted Protein Degradation. DOI: 10.1021/jacs.1c04841. J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 37, 15073–15083

4、4、TF-PROTACs Enable Targeted Degradation of Transcription Factors.J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 23, 8902–8910. doi.org/10.1021/jacs.1c03852