焦磷酸测序（Pyrosequencing）原理与应用

焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是目前最理想的验证方法。因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。

基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平台，应用焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术，不仅解决了常规的焦磷酸测序法在非CpG位点胞嘧啶转化为胸腺嘧啶时影响到引物的结合， 进一步提高了结果的准确性；同时，给予的结果除了能准确定性检测到位点变化情况之外，还能精确地计算频率变化。

基本原理

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是由4种酶（DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。

ATP硫酸化酶催化PPi与5'-磷酰硫酸（APS）结合形成ATP，然后在荧光素酶的催化作用下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可 见光。CCD感应器检测到光信号后，Pyrogram转化为检测峰，每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目呈正比。

Apyrase不断降解未掺入的核苷酸和ATP，淬灭光信号，再生反应体系，以此得到整个结果。

PyroMark流程：

结果展示：

技术优势：

先进的算法设计可优化最佳的实验条件，内嵌式的质控保证数据的准确可靠，全程的软件控制减少人为因素的影响；
灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域；

周期短、通量高，1h内可同时平行分析96个样本，一次运行可实现多个连续CpG位点定量分析；

除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化；

对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；

对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本；

案例分析：

Pyrosequencing技术检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平

研究者利用illumina HumanMethylation27芯片对9例样本（4例正常，5例宫颈癌）进行全基因组启动子区甲基化扫描，结果显示宫颈癌患者UTF1启动子区域呈 现出高的甲基化状态。为了验证芯片筛选的结果，采用焦磷酸测序方法首先对这些样本的UTF1启动子区域进行深入分析，结果表明正常宫颈中UTF1启动子区 域呈现低甲基化状态，而相同的位点在SCC中呈现高甲基化状态。为了进一步验证，研究者扩大样本量，对47例不同类型的石蜡包埋组织样本及10例白细胞进 行焦磷酸测序检测，与之前的结论保持一致。结合RNA水平和蛋白水平的实验，研究者最后提出UTF1启动子甲基化状态可以作为宫颈癌诊断的一个重要的分子 标志物。

原始出处：

Guenin S, Mouallif M, Deplus R, Lampe X, Krusy N, Calonne E, Delbecque K, Kridelka F, Fuks F, Ennaji MM, Delvenne P.Aberrant promoter methylation and expression of UTF1 during cervical carcinogenesis.PLoS One. 2012;7(8):e42704.

焦磷酸测序检测四种不同类型样本中甲基化状态