盘点：CRISPR基因编辑技术或有望治疗癌症和HIV等顽疾

CRISPR/Cas系统是大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，其全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统，能够以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。近年来以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，比如艾滋病、血液病、肿瘤等多种人类顽疾；那么近期CRISPR-Cas9基因编辑系统在治疗癌症和HIV上有哪些突破性进展呢？小编对此进行了盘点，与各位一起学习！

【1】利用CRISPR治疗癌症？

根据美国国家卫生研究院（NIH）的说法，美国重组DNA顾问委员会（Recombinant DNA Advisory Committee，RAC）下周将审查宾夕法尼亚大学申请首次利用革命性的基因编辑技术CRISPR治疗人类癌症的临床试验。利用CRISPR技术，科学家们能够准确地切割靶DNA。

这项临床研究将从癌症患者体内提取出免疫系统的T细胞。接着，研究人员将利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因修饰后的T细胞灌注回病人体内，这样它们将靶向摧毁肿瘤细胞。

NIH科学政策副主任Carrie Wolinetz在一篇博客帖子中披露了这一审查信息。宾夕法尼亚大学正在开发的这种癌症免疫疗法旨在靶向攻击骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤。

CRISPR技术是在不到四年前开发出来的，但是已正在冲向临床应用。在此之前，一家位于美国马萨诸塞州剑桥市的生物技术公司Editas医药公司（Editas Medicine）说，它打算在2017年开展一项利用CRISPR治疗一种罕见的眼部疾病的临床试验。

【2】Cell：让CRISPR在癌症领域大放异彩

第一次CRISPR-Cas9基因编辑技术被用于整体生物模型中系统地靶向基因组中的每一个基因。来自Broad研究所和麻省理工学院David H. Koch综合癌症研究所的一个科学家小组，率先利用这一技术在一个癌症动物模型中系统地“敲除”（关闭）了整个基因组的所有基因，揭示出了与肿瘤进化和转移相关的一些基因，这为在其他细胞类型和疾病中从事类似的研究铺平了道路。这项研究工作在线发表在3月5日的《细胞》（Cell）杂志上。

共同资深作者、哈佛-麻省理工Broad研究所核心成员、麻省理工McGovern脑研究所研究员、麻省理工学院大脑、认知科学与生物工程学系助理教授张锋（Feng Zhang）说：“全基因组向导RNA(guide RNA， gRNA)库是一个强大的筛查系统，我们带着激动的心情开始将它应用于动物模型中来研究基因功能。这项研究是朝着利用Cas9在体内鉴别癌症和其他复杂疾病中的重要基因迈出的第一步。”

【3】JNCI：重磅！科学家利用CRISPR/Cas9技术使癌症突变失活

doi：10.1093/jnci/djw183

由于在许多生物医学和生物技术领域均有着广泛的应用，“基因魔剪”CRISPR/Cas9或将完全打开癌症研究领域的大门；日前一项刊登在国际杂志Journal of the National Cancer Institute上的研究报告中，来自德国德累斯顿工业大学 （Dresden University of Technology）等机构的研究人员通过研究发现，扮演癌症驱动子的突变或许能够被靶向作用并且修复，而且这些相关的突变也可以被快速诊断，并被用来改善个体化疗法。

作为生物技术研究领域的革命性工具，CRISPR/Cas9在生物医学研究上有着其广泛的用途，其可以实现对细胞基因组中特定位点的DNA进行切割，如今研究人员就发现了一种方法，能够利用该技术诊断并且使得癌症突变失活，从而加速癌症领域的研究。研究者Frank Buchholz说道，通过新一代测序技术我们就能够快速鉴别出癌细胞中的突变，但很多时候我们并不知道到底是哪些突变能够驱动疾病的发生，而且哪些突变是相对良性的。

这项研究中，研究者首先对超过50万个报道的癌症突变进行分析，这些突变从理论上来讲能够被靶向作用，并且超过80%的突变都可以被CRISPR/Cas9系统进行切割修饰；随后研究者人员发现CRISPR/Cas9可以在不明显靶向作用健康野生型等位基因的同时，对一系列常见的癌症突变进行特异性靶向作用；此外，携带癌症特异性引导RNAs的Cas9酶类的表达还能够揭开引发癌细胞生长和变异的突变。

【4】Nature Biotechnology：利用CRISPR系统筛选癌症药物靶向目标

doi：10.1038/nbt.3235

近日，来自美国冷泉港实验室的研究人员在国际学术期刊nature biotechnology在线发表了一项最新研究进展，他们应用CRISPR-CAS9技术靶向编码蛋白功能性结构域的外显子对癌症药物作用靶点进行大规模筛选，克服了CRISPR-CAS9技术在该方面的技术障碍，对于癌症药物靶点筛选有重要意义。

CRISPR-CAS9基因组编辑技术在发现癌症及其他疾病靶向治疗目标方面具有重要应用前景。目前的筛选策略主要通过靶向CRISPR-CAS9诱导的候选基因5`外显子突变来进行，但这种方法常会产生保留部分功能的框内突变，即使具有很强的遗传相关性也有可能会被掩盖。

在该项研究中，研究人员利用CRISPR-CAS9技术靶向编码蛋白功能结构域的外显子对其进行突变，从而克服了上述问题的限制。这种方法会产生更多的无效突变，大幅度增加了阴性选择的效能。同时，大量的阴性选择可用于推断蛋白质不同结构域的功能重要性。研究人员利用这一方法对小鼠急性髓系白血病细胞的192个染色质调节性区域进行了筛选，发现了6个已知的药物靶点和19个潜在药物靶点。

【5】Nat Med：利用CRISPR-Cas9进行全基因组筛选找到胰腺肿瘤弱点

doi：10.1038/nm.4219

在科学家们建立了CRISPR-Cas9基因编辑技术之后，该技术得到了广泛利用。一些研究利用CRISPR-Cas9基因编辑工具进行基因筛选，在癌细胞内找到了一些可以用于开发潜在治疗方法的基因弱点。

最近，来自加拿大多伦多大学的研究人员在RNF43突变的胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中进行了全基因组范围的CRISPR-Cas9筛选，并找到了可以用于治疗该类型癌症的潜在抗体药物。这种类型的PDAC依赖Wnt信号进行增殖。

在这项研究中，研究人员通过筛选发现一个有FZD5参与的Wnt信号通路对于携带RNF突变的PDAC细胞的增殖有重要作用，FZD5是人类基因组编码的10个Frizzled受体中的一个。研究结果表明该Wnt受体的表达水平存在背景依赖性特征。研究人员利用一组重组抗体检测FZD蛋白的表达，证实FZD5的功能特征无法通过蛋白表达情况来解释。

【6】Cell子刊：利用CRISPR/Cas9技术鉴定出AML白血病细胞的弱点

doi：10.1016/j.celrep.2016.09.079

在一项新的研究中，来自英国剑桥大学韦尔科姆基金会桑格研究所的研究人员和他们的合作者对一种CRISPR基因编辑技术进行改进，并利用它发现急性髓性白血病（AML）的新的治疗靶标。他们鉴定出大量基因可能作为抗AML疗法的潜在靶标，并且描述了抑制这些基因中的一种，即KAT2A，如何破坏AML细胞，同时不会伤害非白血病血细胞。相关研究结果发表在2016年10月18日那期Cell Reports期刊上，论文标题为“A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia”。

AML是一种侵袭性血癌。AML细胞（一种癌细胞）将骨髓中的健康细胞挤出去。它们快速地增殖和干扰骨髓制造正常血细胞的能力，从而导致威胁生命的感染和流血。主流AML疗法在几十年内并未发生变化，而且不到三分之一的AML患者在这种癌症中存活下来。

为了鉴定出治疗AML的新方法，研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对AML细胞进行筛选以便寻找它们的弱点。这种技术能够被用来破坏和摧毁细胞基因组中的靶基因。为了实现这一目标，他们对CRISPR-Cas9技术进行优化，以便高效地逐个地破坏AML细胞基因组中的所有基因。这允许他们鉴定出那些遭受破坏后对AML细胞的生长和存活是有害的基因。

【7】Nature：大师级牛人用CRISPR构建癌症类器官

doi：10.1038/nature14415

肠道上皮是人体内细胞更新最快的组织，可以迅速更新和修复肠粘膜，但这种能力也带来了一定的风险。人们发现，肠道的隐窝干细胞（Crypt stem cell）可能起始肿瘤形成，在肿瘤细胞的分化、增殖及凋亡中发挥重要作用。

用含有干细胞巢蛋白（WNT、R-spondin、表皮生长因子EGF）的培养基，可以长期培养小鼠和人类的肠道干细胞，生成遗传学和表型稳定的上皮类器官。荷兰艺术与皇家科学院主席、美国国家科学院院士Hans Clevers教授领导研究团队，利用CRISPR/Cas9技术建立了结直肠癌（CRC）类器官。这一研究成果发表在本周的Nature杂志上。

结直肠癌通常是由腺瘤缓慢发展而成，这说明结直肠癌发展很可能是一个陆续获得基因突变的过程。研究人员将CRISPR/Cas9技术用于体外培养的人类肠道干细胞，陆续引入了四个最常见的结直肠癌基因突变（APC、P53、KRAS和SMAD4）。他们通过去除培养基中的生长因子，来筛选发生了突变的细胞。

【8】Nat Commu：大刀砍向HIV病毒——CRISPR系统初步成功应用

doi：10.1038/ncomms7413

想象一下，一个成分单一的药物，可以防止人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，也能治疗已经感染艾滋病毒的患者，甚至能清除比HIV更厉害的病毒的所有休眠副本。这听起来像科幻小说，但已经有科学家们开始一步步接近于这个目标。他们通过定义和利用细菌和基因剪刀手CRISPR/Cas9系统，为细胞创造了一个新的防御系统。这篇研究成果，发表在最新的Nature Communications。

当HIV病毒复制潜入人体细胞，它们就会导致混乱。它使用细胞本身的分子机制制成病毒遗传物质的副本，这些副本随后埋葬细胞自身的基因。从此之后，主体细胞变成一个HIV工厂，使得病毒大量复制，以遍布全身。现有的HIV药物主要瞄准这一生命周期中的各个步骤：比如说一些阻止病毒整合进入细胞的DNA，而另一些尝试包括停止受HIV影响的细胞生产更多的病毒。不过这些药物的问题在于它们不能真正删除那些隐藏在细胞的病毒DNA。这些病毒可以保持休眠状态数年之久，然后再次激活。所以病人通常需要每天或每周的使用药物来保障他们的生活，因为HIV可以潜伏。不过这样花费的金钱，时间和精力实在难以估量。

【9】Cell子刊：CRISPR直击HIV感染的预防和治愈

CRISPR是最近备受推崇的基因组编辑技术，它能够高效而精准地编辑基因组中几乎所有的序列，这将大大促进疾病研究和新疗法开发。著名科学期刊《Cell Reports》日前发布了一项新成果，科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在人体免疫T细胞内对45个与HIV入侵宿主相关的基因进行特殊编辑分析，甄别出了其中某些基因经编辑改造发生突变后，可保护T细胞免受HIV病毒的侵入、整合、转染。这对于彻底清除HIV病毒、预防和治愈艾滋病有重要意义。

HIV病毒全称人类免疫缺陷病毒，它是导致艾滋病（AIDS）的罪魁祸首。HIV 感染人体后，侵入并破坏CD4阳性的T淋巴细胞，导致免疫系统功能不断下降，使患者越来越容易遭受大量其它感染和疾病的侵袭而最终死亡。艾滋病是一个遍布全世界的公共健康问题，根据WHO统计，2014年全球HIV感染人口接近4000万，其中新增感染人数200万。由于近年来抗病毒疗法的不断进步，特别是多种抗病毒药物组合的“鸡尾酒”疗法问世后，艾滋病可获得长期有效控制，已逐步变成了一种慢性、可控的疾病。但现有疗法始终无法彻底清除体内HIV病毒，容易死灰复燃。如何彻底消除体内潜伏残留HIV病毒，如何预防T 细胞不被HIV重新感染，是现今艾滋病治疗的重要难题。

【10】Nature子刊：利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1

doi：10.1038/srep22555

人免疫缺陷病毒（HIV）导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS），即艾滋病。在一项新的研究中，来自美国天普大学路易斯-卡茨医学院（Lewis Katz School of Medicine at Temple University）的研究人员开发出一种特定的基因编辑系统CRISPR/Cas9，从而为最终治愈HIV感染铺平道路。他们证实利用这种基因编辑系统能够有效地和安全地将这种病毒从在体外培养的人T细胞的DNA中清理掉。相关研究结果于2016年3月4日在线发表在自然出版集团旗下的Scientific Reports期刊上，论文标题为“Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing”。

论文共同通信作者、天普大学路易斯-卡茨医学院综合NeuroAIDS中心主任、神经病毒学中心主任、神经科学系主任和教授Kamel Khalili博士说，“抗逆转录病毒药物非常善于控制HIV感染。但是接受抗逆转病毒药物治疗的病人一旦停止服用药物，就会遭遇到HIV复制快速反弹。”大量HIV拷贝的存在削弱免疫系统，最终导致AIDS。

治愈HIV/AIDS---自从上个世纪八十年代首次发现HIV以来，它已夺去了2500万多人的生命---是HIV研究的最终目标。但是一旦它整合进CD4+ T细胞---HIV感染的主要细胞---的基因组后，清除这种病毒已被证明非常困难。近期的努力有意专注于重新激活HIV以便触发强劲的免疫反应从而能够从被感染的细胞中根除这种病毒。然而，在此之前，这些“激活并杀死（shock and kill）”方法中没有一种获得成功。

原始出处：

[1]Jef Akst Treating Cancer with CRISPR？ Science June 17， 2016

[2] Chen et al.Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, Cell (2015). DOI: 10.1016/j.cell.2015.02.038

[3]C Gebler，T Lohoff，M Paszkowskirogacz，J Mircetic et.al.Inactivation of Cancer Mutations Utilizing CRISPR/Cas9.Journal of the National Cancer Institute 2016， 109(1)：djw183

[4]Junwei Shi， Eric Wang，Joseph P Milazzo，Zihua Wang et.al.Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains Nature Biotechnology

[5]Zachary Steinhart，Zvezdan Pavlovic，Megha Chandrashekharet.al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt–FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors Nature Medicine

[6]Konstantinos Tzelepis，Hiroko Koike-Yusa，Etienne De Braekeleer et.al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia Cell Metabolism

[7]Jarno Drost，Richard H. van Jaarsveld，Bas Ponsioenet.al.Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells Nature

[8]Jarno Drost，Richard H. van Jaarsveld，Bas Ponsioenet.al.Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells Nature

[9]JF Hultquist，K Schumann，JM Woo et.al.A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells Cell Reports 2016， 17(5)：1438-1452

[10]Rafal Kaminski， Yilan Chen， Tracy Fischer et.al.Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing Scientific Reports