Cell Reports 同济大学项耀祖教授团队发现定位于心肌梗死进展区Bhlhe41+巨噬细胞亚群并揭示其心脏保护作用机制

过去几十年来，人们越来越多地认识到免疫系统为心脏发育、结构和功能做出了重要贡献。免疫细胞在妊娠时会浸润心脏并驻留在心肌参与维持心脏基本功能直至生命终点。心肌梗死(myocardial infarction, MI)后，大量免疫细胞募集到心脏中以去除坏死的组织并促进愈合。但在某些情况下，免疫细胞会导致不可逆的损害，诱发心力衰竭。钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂通过减少心肌细胞死亡和调节免疫反应呈现出较强心脏保护作用(Protein Cell. 2022 May;13(5):336-359)，但是否对免疫细胞有直接作用尚不清楚。免疫细胞包括中性粒细胞和B淋巴细胞，在MI心肌损伤与修复过程中发挥了重要作用(J Clin Invest. 2022 Jan 4;132(1):e151268；Basic Res Cardiol. 2022 Sep 28;117(1):47)，但是MI后从单核细胞到巨噬细胞亚群的动态演变与转化规律尚未完全解析清楚。

2023年9月25日，同济大学项耀祖教授团队在Cell Reports杂志发表了题为“A transient wave of Bhlhe41+ resident macrophages enables remodeling of the developing infarcted myocardium”的研究论文。本研究中，作者以SGLT2抑制剂作为工具药和干预策略，联合单细胞-空间转录组学技术、特异性细胞亚群敲除与示踪技术，发现了定位于梗死进展区的、具有显著抑制成纤维细胞活化这一独特功能的Bhlhe41+巨噬细胞亚群，为MI免疫应答的时空调控提供了新的机制见解和干预策略。

既往研究表明，不表达CC类趋化因子受体2型(C-C chemokine receptor type 2, CCR2)的心脏常驻巨噬细胞是最早应答心肌损伤的免疫细胞之一，并在MI后大幅度减少。这类巨噬细胞起源于卵黄囊和胎儿肝脏，在MI后心室重塑中具有重要的保护作用。而循环中的单核细胞则高表达CCR2，并依赖其动员至梗死部位，随后分化为CCR2+巨噬细胞大量取代CCR2-常驻巨噬细胞。作者通过单细胞测序发现Bhlhe41在MI后单核来源的巨噬细胞亚群(Mϕ3亚群)中转录激活，该亚群来源于单核细胞但低表达CCR2。流式分析明确了Bhlhe41+巨噬细胞在MI后第1天出现、第7天达峰，并在MI后14天消失，提示其在损伤心脏中短暂驻留(图1)。

图1. Bhlhe41在心梗后巨噬细胞中特异性激活

因Bhlhe41+巨噬细胞亚群既应答MI又响应SGLT2抑制剂的治疗，推测其在心梗损伤修复过程中具有重要意义。作者利用空间转录组测序结合单细胞测序技术，深入探究了MI后不同细胞类型的空间定位(图2)。根据空间聚类、不同细胞类型标记基因定位差异以及每个位置的细胞类型构成，作者精确划分了梗死区(免疫细胞浸润)、边界区(心肌成纤维细胞富集)以及远端区(心肌细胞主导)。随后，作者将梗死区进一步分为老梗死区和进展性梗死区，前者为最初发生梗死的部位，后者为随着时间推进不断扩张的部位，其中Bhlhe41+巨噬细胞被识别定位于梗死进展区，提示其可能与梗死区的扩张相关。

图2. Bhlhe41+巨噬细胞特异性定位于进展性梗死区

Bhlhe41+巨噬细胞独特的时空定位，提示其在心梗微环境中发挥了重要作用。通路分析显示该亚群脂质代谢、胶原代谢相关通路显著激活，推测其与MI后心脏重塑具有密切关联。作者进一步通过共培养巨噬细胞、心肌细胞和成纤维细胞实验分析该亚群细胞的功能(图3)。与CCR2hi巨噬细胞相比，Bhlhe41+巨噬细胞显著增强心肌细胞存活率，并抑制肌成纤维细胞过度激活来发挥心脏保护作用。空间细胞互作分析与体外实验验证发现，Bhlhe41+巨噬细胞通过增加GRN的表达和分泌来拮抗TNF-α对Tnfrsf1a (TNFR1)的影响，从而抑制肌成纤维细胞活化。

图3. Bhlhe41+巨噬细胞抑制肌成纤维细胞激活

为了更准确地示踪Bhlhe41+巨噬细胞，作者构建了Bhlhe41-dTomato-Cre小鼠，以示踪梗死心脏中Bhlhe41激活情况(图4)。与假手术组相比，MI后第3天，dTomato荧光出现在小鼠心脏梗死区，并且与巨噬细胞标记物CD68共定位。相比之下，在Bhlhe41-dTomato-Cre+/-小鼠的心脏切片中没有检测到任何dTomato荧光，表明Bhlhe41在常驻巨噬细胞中不表达。与野生型(WT)小鼠相比，Bhlhe41-dTomato-Cre-/- (Bhlhe41敲除)小鼠表现出梗死面积增加和左心室壁厚度减少(图4)。在MI后第7天，与WT组相比，Bhlhe41敲除小鼠的心脏重量与胫骨长度的比率较高、心脏损伤程度随着MI时间的延长而增加并且心功能明显受损。这些结果共同证明，Bhlhe41+巨噬细胞在梗死区被特异性诱导，并有助于限制梗死区的扩张。

图4. Bhlhe41缺失使小鼠MI后心功能恶化

综上，本文结合单细胞-空间转录组测序和细胞亚群示踪小鼠来表征心脏巨噬细胞亚群响应MI的时空动态，提供了小鼠MI后心脏巨噬细胞的时空转录图谱。作者鉴定出在进展性梗死区中短暂出现了单核细胞衍生的Bhlhe41+巨噬细胞，其在第7天达峰。通过Bhlhe41+巨噬细胞共培养体系和Bhlhe41+巨噬细胞耗竭小鼠进行功能表征，揭示了Bhlhe41+巨噬细胞在抑制肌成纤维细胞活化中的重要贡献(图5)。本研究阐明了心梗微环境对巨噬细胞表型和可塑性方面的影响以及梗死区巨噬细胞功能差异和时空异质性，并强调了Bhlhe41+巨噬细胞在限制梗死面积扩大方面的重要性，也为缺血性心脏病的免疫治疗提供可参考的解决方案。

图5. 心梗后定位于梗死进展区的Bhlhe41+巨噬细胞抑制成纤维细胞活化

同济大学生命科学与技术学院、同济大学附属东方医院项耀祖教授为本文的通讯作者。同济大学生命科学与技术学院、同济大学附属东方医院项耀祖课题组博士后徐越和姜凯为本文的共同第一作者。该研究得到了科技部、基金委和上海市科委项目支持。

原文链接：

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01186-5