脓毒症异质性：具有临床应用价值的生物标志物新证据
2019-06-02 张恺 张根生 重症医学
前言 自从30年前脓毒症定义首次达成共识以来，我们对预测脓毒症预后临床指标的理解不断提升，这促成了脓毒症分类方案的形成。然而，现行的脓毒症定义仍不精确，临床诊断与感染存在的事后分析相关性差。此外，脓毒症的结局还取决于患者体征和症状以外的其他因素，包括年龄、感染部位及是否及时有效的治疗干预(图1)。目前，利用新型转化高通量工具和分析方法来定义不同的宿主反应亚型，有希望得以“从预后预测”转向“从
前言
自从30年前脓毒症定义首次达成共识以来，我们对预测脓毒症预后临床指标的理解不断提升，这促成了脓毒症分类方案的形成。然而，现行的脓毒症定义仍不精确，临床诊断与感染存在的事后分析相关性差。此外，脓毒症的结局还取决于患者体征和症状以外的其他因素，包括年龄、感染部位及是否及时有效的治疗干预(图1)。目前，利用新型转化高通量工具和分析方法来定义不同的宿主反应亚型，有希望得以“从预后预测”转向“从病理生物学驱动”这种方式来理解机体对脓毒症反应之间的异质性。现在人们已经很好地认识到生物学标记物可以更好帮助脓毒症分类，更便利鉴定不同患者亚型，或内源性表型(endotypes)。
过度的免疫激活和免疫抑制，是脓毒症病理生理学的核心。免疫抑制判断的一种临床方式是观察其是否发生院内感染。然而，ICU获得性感染的发生并不是脓毒症患者所特有，事实上，其发生率与入住ICU时无感染征象患者相当。这些结果提示除针对感染的免疫反应之外，机体其他的机制如内皮细胞活化、凝血障碍、葡萄糖和蛋白质代谢等也参与了感染的发生发展。目前，针对这些途径中紊乱的不同亚型得以鉴定，并发现其对治疗有不同的反应以及具有不同的预后(结局)。
在这一章节，着重阐述一些转化生物学的最新相关进展，旨在帮助理解脓毒症患者的异质性。我们专注于使用分子和代谢组学特征以及新的细胞功能研究，来鉴定不同的脓毒症表型 (表1)。鉴别脓毒症患者特有的生物学标记物，可以帮助临床试验更合理的筛选入组患者；更重要的是，能够提高我们对脓毒症的诊断、预后和个体化治疗的水平。
转录组分析
针对脓毒症个体间转录组的变异，最近一些大的队列研究对此进行了评估，免疫反应表型的功能失调是一个共同的主题。这些研究的临床样本包括确诊或怀疑感染的入住ICU 24小时内患者的外周血白细胞。在推导队列中采用无监督的层次聚类方法对25,000长度的全基因组序列（包括基因表达芯片和RNA测序）特征进行分析，用以鉴定患者的不同亚型，随后对该结果在至少一个验证队列中进行验证。这些复杂的数据驱动方法可以鉴定不同的基因表达模式，以此定义代表不同疾病状态的分子亚群而不需要参考临床预后，但这些基因表达模式也可能与不同疾病状态相关。这一方法还可以定义患者的群体特征如个体发病前状态（如年龄、合并症）、疾病分期和严重性、死亡率和遗传倾向。然而，这些临床特征并不能用作区分亚型的依据。
最早期一项研究，采用无监督的层次聚类法对重症监护室患者进行脓毒症亚型分析，病人是来自美国一儿科重症监护室的98名脓毒症休克患儿。研究通过不同的全基因组表达方式确定了3个亚类：内源性类型A(29%)，内源性类型B(46%)，内源性类型C(26%)。这3个亚型在临床特征上差异显著，包括ICU内死亡率 (A型最高为36%，B型和C型分别为11%和12%)，病情严重程度和器官衰竭程度 (A型均为最高)，年龄(A型最年幼)。从生物学角度上来看这些差异也是非常合理的，因为内型A其信号通路最混杂，对适应性免疫通路、糖皮质激素受体信号以及锌稳态关键基因产生抑制。
近期，在成人重症患者的研究中也采用相似的研究方法。作为脓毒症基因组研究[Genomic Advances in Sepsis (GAinS)]的一部分，来自英国29个ICU的265名由社区获得性肺炎发展为脓毒症的患者参与了研究，通过转录组信息将他们分为两个脓毒症反应特征亚型[sepsis response signatures, SRS 1 (41%)，SRS 2 (59%)]。与SRS 2相比，SRS 1患者14天死亡率更高（22% vs.10%）。SRS 1亚型与免疫相对抑制、内毒素耐受、T细胞耗竭、人类白细胞(HLA)2类抗原下调、代谢紊乱(氧化磷酸化向糖酵解转化)有关。在3,000多个差异表达基因中，筛选出7个基因可以较可靠预计SRS的分型。在未来的研究中，前瞻性分配到SRS 1亚型的患者，通过增强免疫系统和预防院内感染可能使这类患者更加获益。
该团队使用同样的研究方法对117例粪腹膜炎（fecal peritonitis, FP）患者基因表达模式进行了研究，同样鉴定出2个不同的亚型（SRS1-FP占46%，SRS2-FP占54%），SRS1患者其14天死亡率同样较高（19% vs. 4%）。该研究所发现的粪腹膜炎患者亚型与之前社区获得性肺炎研究中发现的SRS亚型有很强的相关性，再次显示SRS1亚型不仅富集与内毒素耐受和T细胞活化相关基因，同时还包括与细胞死亡、凋亡和坏死相关基因。在1000多个差异性表达的基因中，衍生出由6个基因组成的一个简单组合可以用来预测亚型分析。值得注意的是，当研究人员将区分SRS亚型的基因表达模式用于上述儿童脓毒症休克研究的队列中时，并没有观察到类似的富集现象(比如SRS1-FP和内源性类型A)。
作为脓毒症分子诊断和风险分层项目(the Molecular Diagnosis and Risk Stratification of Sepsis, MARS)的一部分，在来自荷兰2个ICU的306名患者中鉴定出4种分子亚型(MARS1-4)。MARS1型28天死亡率最高，达39%，而MARS2型、MARS3型和MARS4型死亡率分别为22%、23%和33%。作为预后最差的MARS1亚型，其固有免疫和适应性免疫有关的基因表达减少(如toll样受体，核因子-κB信号转导，抗原呈递和T细胞受体信号转导)，而细胞代谢途径相关基因表达增多(血红素生物合成)，而这两个过程都能造成免疫耗竭。 MARS2和4亚型上调模式识别和细胞因子通路相关基因(如IL-6、NF-κB、干扰素信号转导以及诱导型一氧化氮合酶)，这些提示过度的炎症反应。最后，MARS3是一种风险较低的亚型，其适应性免疫途径表达增加(如T辅助细胞，自然杀伤细胞，IL-4信号转导，B细胞发育)，该亚型与低风险的SRS2亚型高度相关。研究推导出一种双基因表达比值，可以在患者进入ICU时对其亚型进行分类。
在最近一项大范围脓毒症亚型研究中，对来自包含700名患者的14个转录组数据库分析，根据脓毒症谱发现3个不同的宿主反应簇。它们分别是：(1) 炎症簇（固有免疫信号增强，而适应性免疫信号减弱，其以IL-1受体表达上调、模式识别受体活化以及补体激活增强为标志）；(2) 适应簇（固有免疫和适应性免疫信号均降低，其死亡率较低，以干扰素信号为标志）；(3) 凝血障碍簇（凝血和补体系统调节异常，包括血小板脱颗粒和糖胺聚糖结合）。与先前的研究类似，这三组间在30天死亡率上有区别，炎症组最高，达30%，适应组为8%，凝血障碍组为25%。一种含33个基因的简化分类得以开发并可对簇群分类，高死亡率的炎症组与先前的SRS1亚型相对应，而低死亡率的适应组与SRS2亚型相对应。
早期的转录变化也可以鉴定入住ICU时脓毒症是否存在相关并发症。我们小组调查了57名脓毒症患者后发现，根据早期中性粒细胞对感染反应的关键介质差异性表达，可以对脓毒症患者是否合并ARDS做出鉴别（发生ARDS患者有29人，未发生的有28人），而这一差异与中性粒细胞计数无关。
迄今为止，针对脓毒症全基因组表达研究都是采用全血白细胞。然而，在不同免疫粒细胞和淋巴细胞亚群中存在不同的基因表达 。由于转录谱特性依赖于炎症细胞类型，这些用来区分不同类别的基因表达模式可能反映不同白细胞群体，而不是基因表达的细胞内差异。这些发现需要在不同国家的大量人群中进行验证，因为种族差异是影响基因表达的重要决定因素。然而，这些研究在脓毒症不同分子表达途径、宿主对脓毒症反应不同分类以及对不同亚型患者采取潜在新型治疗靶点等，提供一些证据。此外，每项研究提出了具有潜力的“降维”方法，将高维数据降维成可控的预计信号，以便能够嵌入简单的床旁检测，旨在帮助转化这些成果用于临床。
mRNA和蛋白质特征
血浆蛋白量化分析是一种对脓毒症患者进行生物学亚组分类的更为成熟可行的方法，已有大量研究使用该方法对脓毒症进行分类，但这超出了本文的讨论范围。通过结合分子和蛋白标志物去预测脓毒症休克患者的预后并进行脓毒症亚组分类，是一种值得关注的新方法。通过结合包含5种血浆蛋白标志物的危险分层评分系统以及用于死亡风险评估的4类基因，同样应用该方法对儿童感染性休克患者进行危险分层。该评分系统在预测28天死亡率方面显著提高，它的特征曲线下面积(AUC)从原先的0.78提升到了0.91。这些血浆生物标志物与炎症反应失调和细胞损伤有关，然而这些基因与肿瘤蛋白53 (TP53, p53)相关，其为抑制肿瘤的转录因子，能预防细胞基因组的损伤和功能维持。综上所述，这一方法为应用生物学途径预计脓毒症休克不良结局提供了一合理假设。
代谢组学
代谢组学是一种广泛的但不太熟悉的探究脓毒症异质性的方法。它指的是综合评估任何生物样本中的小代谢物，其代表基因表达、酶活性、生理蓝图 (landscape) 的综合“快照”。利用核磁共振 (nuclear magnetic resonance, NMR)光谱或质谱分析法，可以在细胞、组织或生物液体 (血液成分、尿液)中检测到5,000多种代谢物，后者检测更灵敏，能检测到低丰度的代谢产物。代谢产物包括内源性（脂质、碳水化合物、氨基酸、核酸）和外源性（微生物成分和副产物）化合物。内源性代谢物浓度的变化与生物学代谢途径相关，而改变的幅度与疾病的阶段相关，代谢组学特征是对转录组和蛋白组变化的显著放大。目前还仅仅为回顾性小样本研究。
利用核磁共振氢光谱分析，来比较脓毒症患者和重症监护室对照患者的血清样本，在60种代谢物中有31种可用来区别感染性休克或对照，并开发了一种能够区分这两类患者群体的复合生物标志物模型。这些代谢物参与机体的能量代谢，包括葡萄糖、3-羟基丁酸盐、乙酰肉碱、琥珀酸、肌酸以及磷酸肌酸，另外还包括支链氨基酸和精氨酸。这些结果提示在脓毒症的早期阶段，参与能量代谢的代谢产物在脓毒症的病理生理学过程中起着重要的作用。
在一项利用质谱分析法研究血浆中低浓度代谢物的实验中，研究人员发现参与能量代谢的代谢产物的改变，能够在脓毒症患者是否生存或死亡中起到关键性区别作用。在一项纳入了1818名严重脓毒症和脓毒症休克患者的ALBIOS实验的亚组研究中，研究人员选取20名患者，他们的28天死亡率为45%，在第1天和第7天提取血浆样本进行分析。他们发现死亡组与生存组之间有137种代谢产物存在明显差别，其中差别最显著的是磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱含量的减少，和犬尿氨酸(kynurenine)含量的增加。脂质种类尤其是长链多不饱和脂肪酸的减少可能会导致过度的T细胞活化和免疫反应。
在纳入1152名怀疑脓毒症患者的CAPSOD研究中，研究人员也采用相似的方法，对其中150名患者的血浆代谢组进行了质谱分析。在439种目标代谢物中，有214种在第0小时和第24小时这两个时间点都能检测出来。各种类型感染（肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）间比较，结果显示这些代谢产物在这两个时间点的含量没有区别；对于脓毒症的死亡和生存两组间比较显示： 76种代谢产物在第0小时有区别， 128种在第24小时有区别。在脓毒症死亡和生存组间，酰基肉碱酯和支链氨基酸的差异最为明显，这表明脂肪酸β氧化中的肉碱穿梭过程受损。脂肪酸转运、糖异生和柠檬酸循环也发生不同程度的紊乱。
另一个大样本人群研究使用了质谱分析法，对60名重症监护室生存者和30名死亡者的代谢生物标志物进行了代谢组学分析，发现有57种代谢物与28天死亡率相关[30]，其中有31种在前文的CAPSOD研究的验证队列中同样被检测出 。这些代谢物包括多种脂质、碳水化合物、氨基酸和核苷酸产物。高水平的酪氨酸和苯丙氨酸分解代谢产物、低水平的脂质代谢物与死亡率相关。虽然该研究使用的代谢组学数据集与之前CAPSOD研究相同，但发现了一个完全不同的可用于预测28天死亡风险的代谢产物互作网络系统，这些结果提示不能仅仅关注单个代谢标志物，因为脓毒症不同阶段的病理生理过程与多个代谢物相关。
目前，在一项利用质谱来分析脓毒症患者代谢物的最大样本量的研究中，共有406例患者纳入研究，其中268例患者分配到开发队列 (discovery cohort)[系统炎症反应综合征(SIRS) 42例，社区获得性脓毒症67例，腹腔内感染60例，尿路感染73例，血液系统感染26例]。同样的，与SIRS患者相比，脓毒症患者的酰基肉碱和脂质都发生了改变。利用鞘磷脂和甘油磷脂开发的模型可以区分SIRS和脓毒症患者，其受试者曲线下面积为0.9。分析还表明，不同的感染部位是导致代谢物之间异质性的来源。由此，建立了一个代谢物模型来预测各种不同感染类型的不良预后。
细胞功能
虽然分子、蛋白质和代谢组学生物标志物与脓毒症及其结局间建立了一些相关关系，但还不能确立明确的因果关系，因此，研究这些关系与脓毒症病理间的联系是非常必要的。两种具有潜力用来研究细胞功能与脓毒症病理生理学体外关系的高通量技术包括流式细胞仪和电子细胞基质阻抗传感器 (electric cell-substrate impedance sensing, ECIS)。
免疫表型法包括使用流式细胞仪和荧光标记的多克隆抗体，同时对细胞表面多个靶点进行标记，比如免疫功能障碍相关的标记。在英国进行的一项包含138例ICU患者的研究中，发现白细胞功能障碍，免疫表型表现为中性粒细胞CD88下调、单核细胞HLA-DR表达降低或者调节性T细胞(CD4+, CD25++, CD127low)比例升高，其与院内感染的发生密切相关。脓毒症中可观察到淋巴细胞功能障碍，并能以程序性凋亡蛋白PD1及其配体PDL1的表达水平来量化，这些分子能促进细胞凋亡。将22例脓毒症患者的外周血单核细胞与健康对照组进行比较，发现脓毒症患者淋巴细胞亚群（CD4 T细胞和B细胞）中PD1和PDL1水平均高于健康对照组。与转录组和代谢组分析结果类似，脓毒症早期固有免疫和适应性免疫的状态也因感染类型而异。因此，对特定感染患者能够鉴定出其特定免疫表型并可指导/修改免疫治疗，这样就可允许精准医学靶向治疗(precision medicine-guided therapy)得以实现。
内皮细胞是脓毒症主要的靶细胞之一。体外检测内皮细胞具有一定难度，我们研究组开发了一项新方法 (ECIS)，用来检测内皮细胞对不同样品的反应异质性。该方法是基于：电流通过单层内皮细胞时，电阻的减少可以反映细胞通透性的增加。当肺内皮细胞与来自经过脂多糖刺激后的35例ICU脓毒症患者白细胞培养上清相互作用后，能够检测到这些肺内皮细胞通透性细微的异质性。同样的实验方法也可用来检测脓毒症休克患者中性粒细胞诱导的内皮细胞损伤，与未合并ARDS患者相比，发现脓毒症休克患者的中性粒细胞更能诱导内皮细胞损伤。该体外血管通透性模型，也能用于研究某些临床药物是否能减轻早期脓毒症的内皮损伤。
挑战与未来方向
研究脓毒症生物学异质性需要克服一些技术障碍，具体如下：(1) 研究纳入标准应该尽量统一，以减少患者的选择偏倚；(2) 采样时间对于亚型鉴定同样非常重要，因为亚型分析是一动态过程，连续抽样检测发现将近50%的患者在进入ICU 5天内会从一种亚型转换为另一种亚型。同样的，变异基因表达的持续时间在不同患者间是不同的，恢复较快的患者其基因往往会更快地恢复正常表达，这进一步强调标准化采样时间的统一是至关重要的。(3) 数据收集也需要标准化，包括目前常用的有意义的临床预后指标，如ICU内、院内、14天、28天、30天或90天死亡率。这些预后代表了不同的终点，并用来描述不同的生物学过程。早期死亡更可能是由脓毒症本身直接造成，而晚期死亡或许是因包括院内感染在内的脓毒症并发症所导致。(4) 在分析阶段，的分析方法的规范化对脓毒症是否能分为2种、3种、4种或更多亚型的确定至关重要。
宿主对脓毒症的反应可能是非特异性的，可以由不同的病原体引起，涉及不同的组织器官。现有证据虽然表明在转录组和代谢组中，可能存在共同宿主反应机制，其不受感染类型（革兰氏阳性或阴性菌感染）或感染来源部位所影响，但现有这样的研究相对较少，当把这些数据集中起来分析，发现存在一种宿主基因表达特征可以帮助区分无菌性感染和细菌性或病毒性感染。因此，目前最大样本量的转录组学分析仅限于细菌性脓毒症。此外，当研究人员对所有脓毒症患者的基因表达数据进行重新分析，当只纳入肺炎和腹膜炎患者时，这也是最常见的两种感染来源，发现感染部位会影响患者亚型的分配。代谢产物同样因感染部位而异，社区获得性肺炎患者与其他感染患者，其代谢产物模式不一样。最近一项关于甲流肺炎患者血浆代谢组学分析的研究发现，细菌培养阳性的肺炎患者与进行机械通气的ICU对照患者间分离出的病毒存在明显差异 。因此，脓毒症亚型真正是否与感染类型以及感染部位无关这个问题，还有待于大规模前瞻性研究。
在将来，根据不同代谢途径来区分宿主对脓毒症的反应或许会成为可能(图2)。将患者分为不同亚组进行针对性治疗，可能使这些患者更受益。针对以通路驱动治疗(pathway-driven therapeutics)这样的临床研究，也能募集到更为合适的入选人群，目前这类试验尚不能取得成功的很大一部分原因就是入选的脓毒症患者异质性太大。
目前，针对候选mRNA、蛋白质和代谢物模型效能这些问题，首先应该进行大样本、多中心、多组别的验证研究。未来合作研究的首要目标应该是进行前瞻性大样本队列研究，对这些脓毒症患者进入ICU时，进行病理生物标志物分析并鉴定其亚型，分析这些表型是否与临床预后相关以及后续的个体化治疗。
结论
应用生物信息学来整合系统生物学（包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学）并联合细胞功能研究，能够对脓毒症进行生物学亚型分析，而这一点仅凭临床上的变量是不能做到的。优化这些新兴的转化方法需要多中心合作、专业知识和研究过程的标准化，包括病人样本收集、分析过程以及数据统计的标准化。由于宿主对脓毒症反应的异质性，在患者进入重症监护室时能快速对其识别所属亚型，需要结合分子、蛋白质、代谢组学和功能特点，去开发一个完整、简单、临床适用的预测模型。建立一套简洁的生物标记物来将患者进行特定亚组分类是有希望的，这也有助于更好地测试/评价未来新的临床治疗方法。最后，通过检测关键生物标志物并结合床边临床指标，旨在提高脓毒症精准医学靶向治疗以及患者预后。
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