Nat Methods：开发出自我编辑的CRISPR条形码

通过调整CRISPR-Cas9基因编辑复合体，使得它在自己的向导RNA（gRNA）位点上发生突变，研究人员开发出一种方法让细胞持续地产生它们自己独特的条形码。根据上周（12月5日）发表在Nature Methods期刊上的一篇论文，这种技术是由美国麻省理工学院和哈佛大学的两个研究团队独立开发的，已在哺乳动物细胞中用于分子记录---正如今年夏天（8月18日）在Science期刊（doi:10.1126/science.aag0511）上描述的那样---和用于谱系追踪。

美国华盛顿大学科学家Aaron McKenna（未参与其中的任何一项研究）说，“它真地是一项不错的技术---从某种意义上说，你获得一个能够产生非常多样化的编辑模式和能够开始编码越来越多信息的位点。”

麻省理工学院神经科学家Edward Boyden（也未参与其中的任何一项研究）对此表示同意。“这是非常引入关注的研究，这是因为它可能有助标记有机体中不同的细胞---因此它们容易被区分开来。”

McKenna说，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统将关于一种细胞的信息插入到它自己的基因组中---这种信息可以关于这种细胞的身份（一种条形码），或者这种细胞接触到的信号分子或其他因子---是一个正在不断成长的创新领域。比如，在5月，McKenna和同事们已描述一种谱系追踪技术：在斑马鱼细胞中，利用CRISPR-Cas9让一组人工合成的DNA元件发生累积地和不可逆地突变。

McKenna说，但是利用常规的CRISPR-Cas9系统能够产生的突变数量---因此，能够储存的信息数量---是有限的。这种限制来源自CRISPR-Cas9的初始功能：作为一种抵抗入侵的病毒的细菌免疫机制。

在细菌中，Cas9核酸酶通过gRNA靶向入侵的病毒，其中gRNA含有匹配这种病毒的短序列。这些gRNA是由细菌自己的基因组编码的（在之前遭遇这种病毒入侵之后），但是不会遭受Cas9的自我攻击，这是因为它们缺乏特异性的存在于病毒基因组中的是Cas9识别所必需的DNA序列。这些识别病毒的DNA序列被称作前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）。

当利用CRISPR-Cas9系统在真核细胞中产生突变时，可能存在的突变数量受到gRNA本身的限制。在靶DNA元件发生一些突变后，gRNA不再具有足够的序列同源性，因而不能够有效地引导Cas9。

为了增加CRISPR-Cas9系统的信息储存能力，两个研究团队---一个团队由麻省理工学院科学家Tim Lu领导，另一个团队由哈佛大学科学家George Church领导---想出同一种解决方法：让gRNA位点含有一种PAM序列以便能够自我编辑。

Lu解释道，“每次在这个位点引入一种突变时，一种新的gRNA就会产生，从而能够持续自我靶向。”

Lu团队利用它的“自我靶向”CRISPR系统构建出记录炎症的细胞：这些细胞在对小鼠体内的炎性信号作出反应时，会启动gRNA位点发生自我引导的突变。与此同时，Church团队利用它的“自导（homing）”系统追踪体外培养的细胞谱系。

Church实验室研究员Reza Kalhor说，这种自导gRNA系统“在它的位点上产生的多样性是常规的gRNA在它的靶标上的8到10倍。”然而，这种记录能力并不是无止境的。他解释道，“[CRISPR产生的]大量突变往往是缺失突变”，因此在一系列突变后，这种匹配的RNA序列---开始时仅20个核苷酸左右---变得太短而不能发挥功能。Kalhor说，“它基本上是搬起石头砸自己的脚。”

McKenna说，“当然，在未来，还需开展更多的研究来优化这些技术。”