更灵活经济的SNP检测方法：KASP法
2014-03-29 MedSci MedSci原创
近年来，基于SNP分型的全基因组关联分析（Genome Wide Association Studies, GWAS）已经成为一种非常流行的寻找功能基因的研究手段。研究人员通过GWAS研究检测特 定物种中不同个体间全部或大部分基因，来比较不同的表型（Phenotype）分组的大量样本之间存在的基因型（Genotype）差异，从而找到疾病或 表型相关联的重要基因。GWAS技术在遗传疾病机
近年来，基于SNP分型的全基因组关联分析（Genome Wide Association Studies, GWAS）已经成为一种非常流行的寻找功能基因的研究手段。研究人员通过GWAS研究检测特 定物种中不同个体间全部或大部分基因，来比较不同的表型（Phenotype）分组的大量样本之间存在的基因型（Genotype）差异，从而找到疾病或 表型相关联的重要基因。GWAS技术在遗传疾病机理、肿瘤易感性基因分析及农业重要性状基因的筛选工作中发挥了重要作用。
SNP的研究前期通常基于下一代测序（NGS）技术对大量样本进行全基因组测序，通过与参考序列的比对发现并构建SNP数据库，之后多采用设计高密度SNP微阵列芯片对发现的大量SNP进行验证。
下一步则是根据SNP的位置和连锁情况等设计基因芯片或NGS的靶向测序进行全基因组范围内的分析，也就是GWAS研究，这两种技术通量高，速度快，可以分析单个或多个样品的数十万甚至上百万个SNP。
从实验设计来讲，研究的第一阶段采用大量样本的全基因组范围SNP基因分型，经过统计学分析找到少量与 疾病或性状关联的SNPs，随后第二阶段，在更大数量的样本中对这些目标SNPs进行基因分型，最后整合两个阶段的结果进行分析。在第一个阶段，基因芯片 或NGS对于单个样品的大量SNP检测具有优势，而在第二阶段，实验需要检测大量样本的少量SNPs，而此时基因芯片或NGS技术则由于其高成本不太适合 于这个阶段的研究，则需要更适合的技术路线。
英国LGC (Laboratory of the Government Chemist 政府化学家实验室)有限公司成立于1842年，是集实验室服务、测量标准、标准物质及实验室能力验证于一体的市场领导者。LGC基因组学（LGC Genomics）作为其新设的技术部门，为全球的基因组学实验室提供了最新的技术方法和设备，已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。
LGC Genomics公司的解决方案：基于KASP（竞争性等位基因特异性PCR）技术的SNPline基因分型检测方案。
该方案的核心是KASP技术，即Kompetitive Allele-Specific PCR。如图1所示，这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。
便宜而准确的基因SNP分型方法一直是遗传学家追求的手段。LGC公司出品的KASP方法，可以用2个荧光探针、2个通用淬来探针，再加多个位点特异探针来检则多个SNP位点。
优 点
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只要合成两个通用荧光探针，两个通用淬灭探针，再加合成多个针对具体位点的SNP PCR引物，就可以测许多位点
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因为荧光探针、和淬灭探针都很贵，KASP方法相比于Taqman方法，可以通过通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本
第1步：
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设计2个SNP PCR引物，各对应于一个SNP的等位基因，如图:
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Allele 1引物3'末端是C；allele 2引物3'末端是A标签序列
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Allele 1引物5'末端是F序列；allel 2引物5'末端是H标签序列
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设计荧光探针
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F探针与Allele 1标签序列一致；H探针与Allele 2标签序列一致
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F探针的5'端有一个FAM荧光基团；H探针的5'端有一个HEX荧光基团
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相应于F探针和H探针，各设计一个3'端带淬灭基团的淬灭探针
第2步：
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第一轮PCR，模板会与可互补的（3'末端能配对的）PCR引物进行退火，并发生扩增。
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这步完成SNP识别
第3步：
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第2轮PCR扩增，扩增出带有标签序列的PCR产物
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这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物
第4步：
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经过接下来几轮的PCR扩增，一方面淬灭探针被切碎，另一方面荧光探针更多地退火到新合成的、没有淬灭基团的互补链上，发出荧光
实验流程主要包括：
• 准备：1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2）带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；3）DNA 模板
• PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
• PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
• PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。
由于SNPline的高度灵活性，其应用也十分广泛，适合于各种基因分型研究，无论是低通量研发项目，NGS之后的SNP验证，农业种群研究，还是QC和DNA Biobanking等都是其适用的范围。
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