Nature Medicine：cfDNA甲基组用于早期子痫前期检测

子痫前期(PE)是一种非常普遍和严重的妊娠并发症，也是全世界围产期死亡率和患病率的主要原因。早发性和晚发性PE分别被定义为在妊娠34周之前或之后出现。约12%的PE有早发性表现。早发性PE与严重发病率和胎儿死亡率高8倍相关。早期识别孕妇的风险对于及时在妊娠16周之前实施低剂量阿司匹林等降低风险的干预措施至关重要。然而，目前可用的方法是在这个时间窗口内识别有早期PE风险的妊娠要么不敏感，要么敏感性取决于熟练的超声检查人员。因此，需要研究新的、更好的筛查方法。

PE的发病机制尚不完全清楚，但可以明确的是，胎盘在病理生理中起着至关重要的作用，特别是在早发性PE中。虽然通过绒毛膜绒毛取样在妊娠早期对胎盘进行表型分析是可行的，但这种方法具有侵入性，且存在流产风险，极大地阻碍了其作为筛查工具的应用。在妊娠10-12周时，在母体cfDNA的背景下，血浆中平均10%的cfDNA来自胎盘，该cfDNA不仅反映了胎盘基因型，还保留了起源细胞的表观遗传信息，包括核小体位置和DNA甲基化(DNAme)。

近日，一组来自比利时的研究团队在杂志Nature Medicine上发表了一篇题为“Cell-free DNA methylome analysis for early preeclampsia prediction”的文章。在文章中，作者测试了是否可以利用DNAme的变化来预测孕妇PE的进展，并利用这些信息来进行症状前PE检测和潜在的干预。

图片来源：Nature Medicine

主要内容

PE关联的DNAme变化

为了研究cfDNA甲基化(cfDNAme)在早发性PE中的变化，作者首先从诊断PE的患者(n= 64)和足月分娩时的妊娠匹配对照(n= 38)中收集cfDNA(下图a)。所有PE患者平均在妊娠31周发生早产(下图b)。cfDNA在PE患者和对照组之间存在显著差异，PE患者的cfDNA浓度较高，胎儿比例较低，片段大小较小。作者选择了28,898个位点，其中分别有2,068个和1,547个区域显示出显著的DNA低甲基化和高甲基化，其中132个和99个位点通过了多次测试校正(下图c)，且检测到的变化主要归因于5mC的变化。

为了了解这些cfDNAme变化的来源，作者分析表明，在cfDNAme中检测到的变化更多地反映在胎盘来源的DNA中，而不是血细胞来源的DNA；cfDNAme的变化主要发生在与发育相关基因附近，包括那些与滋养细胞分化、胎盘血管形成和胎盘成熟有关的基因。

PE关联的cfDNAme变化。 图片来源：Nature Medicine

通过cfDNAme分析识别PE

在分析cfDNA或胎盘、血细胞DNA时，前200个差异甲基化区域的无监督分层聚类将病例和对照组分开分组(下图e)。作者在cfDNAme数据上训练了一个分类器，最终模型共选择了1,392个位点，将PE与对照妊娠区分开来。交叉验证分析结果表明，该方法曲线下面积(AUC) =0.979（下图f），说明cfDNAme分析可以确认PE诊断。

通过cfDNAme分析识别PE。 图片来源：Nature Medicine

出现PE症状之前cfDNAme的差异

作者从诊断为PE的妇女和匹配的对照组中收集cfDNA样本，这些cfDNA样本主要采集于妊娠的9 - 14周(下图a)。这些cfDNA样本的甲基化分析显示，779和2009个区域分别表现出显著的cfDNA低甲基化和高甲基化，尽管只有6个低甲基化区域在多次测试校正后保留(下图b)。然而，对200个最显著改变区域的无监督分层聚类将大多数病例和对照组分开(下图c)，这表明在大多数PE患者中可以检测到类似的信号。但在妊娠早期，大多数PE相关的cfDNAme变化似乎与PE诊断时可检测到的变化不同。

cfDNAme可以在症状前预测PE

作者评估了妊娠前三个月的cfDNAme分析是否可以用于预测PE。建立了一个新的模型，使用 妊娠早期cfDNAme发现队列中区分PE患者和对照组。10倍交叉验证分析的总AUC为0.766 (下图d)，表明cfDNAme分析可以在妊娠早期识别发生PE的风险。从妊娠第12周开始获得的样本表现出更好的性能，AUC为0.792，而第12周之前获得的样本为0.629。综上所述，作者发现cfDNAme可以使用妊娠12周左右获得的cfDNA预测PE的风险(下图e)。

cfDNAme的改变可以在症状前预测PE。

图片来源：Nature Medicine

预测PE的cfDNAme信号来源

作者构建的模型依赖于来自1,541个位点的cfDNAme数据。为了更好地理解这些cfDNAme信号的来源，作者对排名靠前的位点进行了无监督分层聚类分析，得到了四个簇。簇1和簇2以及簇3和簇4分别包含低甲基化和高甲基化的区域。簇 3显示出细胞类型特异性:在胎盘绒毛膜绒毛组织中，特别是在滋养细胞中，高度甲基化，但在其他来源中没有(下图c)。与簇3和4相关的基因经常参与发育和转录调控(下图d)。基于cfDNAme的评分随着妊娠的进展而下降，在对照组中呈显著负相关，而在PE患者中没有发现相关性(下图e)。数据表明，预测PE的cfDNAme变化中至少有一些是滋养层来源的，它们可能反映了对照组正常的胎盘发育和成熟，以及在继续发展为PE的妊娠中可能出现的延迟。

预测PE发病的cfDNAme差异位点的特征。

图片来源：Nature Medicine

cfDNAme标志物的验证和早期PE预测

为了外部验证早期妊娠cfDNAme模型的预测性能，作者收集了一个额外的队列(n=197)，包括来自两个不同转诊中心的PE患者和无并发症的足月妊娠对照组。在这个独立验证队列中应用cfDNAme模型也显示出了预测性能，总体AUC为0.752(下图b)。使用cfDNAme评分cutoff值0.4187，敏感性为56%，特异性为76%。cfDNAme评分在对照组中随着胎龄的增加而降低，而PE则不存在这种相关性(下图c)。

cfDNAme变化预测PE发作的验证。

图片来源：Nature Medicine

cfDNAme分析提高PE预测灵敏度

PE风险评估目前是根据母体的特征，遵循ePRM模型进行的。该模型包括母亲和妊娠相关因素，包括母亲年龄、胎次、PE史、种族、双胎妊娠和BMI。作者构建了一个学习模型，将这两个分数结合起来。结果显示了，相比单用模型，联合模型显著提高了表现(AUC=0.853) ,在妊娠12周或12周后获得的cfDNA样本分析中更为明显(下图 b)。在80%的特异性下，联合模型的假阴性率为28%，cfDNAme模型为46%， ePRM模型为51% (下图c)。对于妊娠早期PE筛查，特异性为90%被认为是临床可接受的。在这个阈值下，ePRM的敏感性为28% ，cfDNAme的敏感性为38%，联合模型的敏感性为57%。在现有标准风险评估的基础上增加了cfDNAme分析可提高29%的敏感性，并改善了PE风险预测，这表明cfDNAme分析在妊娠早期的pesscreening中是有益的(下图d)。

基于cfDNAme的模型与现有PE风险模型的互补性。

图片来源：Nature Medicine

总结与讨论

早期识别有早发性PE风险的孕妇是很重要的，因为它可以进行有针对性的监测和预防干预。作者在这篇文章中证明了早发性PE与母体血浆cfDNAme的变化是相关的。作者检测了对照组和PE妊娠之间的DNA甲基化差异，使PE诊断时以及在妊娠9-14周症状前能够进行风险分层。在外部队列(AUC = 0.75)中验证了早期妊娠风险预测模型，并联合常规可用的产妇危险因素(AUC= 0.85)。联合风险评分正确预测了72%的早发性PE患者，特异性为80%。作者研究表明观察到的PE相关cfDNAme变化的很大一部分来源是胎盘。对照组的cfDNAme评分随着胎盘成熟而下降，而PE没有，表明早发性PE伴有胎盘发育迟缓或异常，与PE患者的胎盘发育不良假说一致。

研究有一些局限性。作者观察到，在一些早发性PE患者亚组中没有显著差异。cfDNAme是否能够对PE患者的异质亚组进行分层，也需要在更大、种族更多样化的队列中进行进一步评估。同样，这是一项病例对照研究，筛查效果需要在前瞻性队列中进行验证。综上所述，这些初步结果表明，cfDNA甲基化分析是一种有前景的工具，用于症状前PE风险评估，并有可能改善产科诊所的治疗和随访。