构建稳定敲减GRAMD1A的Huh7稳转株

1.构建稳定敲减GRAMD1A的Huh7稳转株
为了进一步探讨GRAMD1A在肝癌细胞放化疗敏感性中的作用，我们利用慢病毒感染进行稳定敲减GRAMD1A的Huh7稳转株构建，经嘌呤霉素筛选后，qPCR和western blot检测发现，与空白对照组和阴性对照组相比，GRAMD1A mRNA和蛋白水平均显著降低（0.98±0.12、1.04±0.07、0.15±0.05；0.90±0.06、0.89±0.09、0.29±0.05；FmRNA=102.151, PmRNA=0.000；Fprotein=77.345, Pprotein=0.000）（图1A，1B），表明我们成功构建了稳定敲减GRAMD1A的Huh7稳转株。

2.沉默GRAMD1A对肝癌Huh7细胞Sorafenib化疗敏感性的影响
为了检测沉默GRAMD1A对肝癌Huh7细胞Sorafenib化疗敏感性影响，我们首先使用不同浓度的Sorafenib处理Huh7细胞，MTT检测细胞活力变化，发现不同浓度的Sorafenib均能抑制Huh7细胞活力，且呈剂量依赖性（100、82.00±4.36、62.00±4.58、33.00±4.58、20.67±3.06，F=232.636，P=0.000）（图2A），其IC50为6.83μM，故我们选择5μM浓度的Sorafenib来进行后续实验研究。我们用5μM的Sorafenib、shGRAMD1A、5μM的Sorafenib联合shGRAMD1A处理细胞，MTT检测细胞活力，PI/Hoechst染色法测细胞死亡，结果发现，Sorafenib联合shGRAMD1A处理Huh7细胞后，细胞活力显著下降（100.00±2.00、63.33±3.21、56.33±5.51、28.33±5.51，F=139.240，P=0.000），细胞死亡显著增加（5.00±1.00、30.67±4.51、20.67±2.52、73.00±4.58，F=208.741，P=0.000）。（图2B，2C）。由此得知，沉默GRAMD1A可增加肝癌Huh7细胞对Sorafenib化疗敏感性。

3.沉默GRAMD1A对Huh7细胞放疗敏感性的影响
放疗后存活分数分析得知，Control+IR组的SF2、D0、Dq分别为82.50、2.030、2.672；shGRAMD1A+IR组的SF2、D0、Dq则分别为52.04、1.332、1.425，shGRAMD1A+IR组的SER为1.524，且shGRAMD1A+IR组较Control+IR组的肩区缩小，各剂量点Huh7的存活分数（survival fraction，SF）均显著降低（图3A）。经2Gy照射后，克隆形成实验发现shGRAMD1A+IR组细胞克隆形成能力显著降低（99.67±1.53、78.33±6.03、73.67±5.51、39.00±5.29，F=78.136，P=0.000）（图3B，3C）；流式细胞仪检测发现shGRAMD1A+IR组细胞凋亡显著增加（F=31.773，P=0.000）（图3D）。由上述结果可知，沉默GRAMD1A可增加Huh7细胞对放疗的敏感性。

4.沉默GRAMD1A对Huh7细胞STAT5及其下游基因表达影响
为了探索沉默GRAMD1A增加Huh7细胞放化疗敏感性是否通过STAT5通路，我们利用qPCR检测了沉默GRAMD1A后，STAT5及其下游Cyclin D1、Bcl2、c-Jun、c-Myc表达，结果发现，STAT5及其下游Cyclin D1、Bcl2、c-Jun、c-Myc表达均显著下调（1.03±0.18、0.47±0.04，t1=5.260，P1=0.006；1.00±0.06、0.23±0.02，t2=21.087，P2=0.000；1.01±0.09、0.35±0.02，t3=12.399，P3=0.000；1.00±0.04、0.38±0.01，t4=26.045，P4=0.000；0.99±0.09、0.34±0.01，t5=12.433，P5=0.000）（图4A）；我们将STAT5的启动子克隆到psi-CHECK2报告载体中，检测发现沉默GRAMD1A可显着降低其萤光素酶活性（1.00、0.28±0.05；t=24.942，P=0.000）（图4B）。上述结果表明，GRAMD1A通过影响STAT5及其下游基因表达来发挥作用。

5.抑制STAT5对Huh7细胞放化疗敏感性的影响
为了进一步验证沉默GRAMD1A可通过抑制STAT5通路来增加Huh7细胞放化疗敏感性，我们使用STAT抑制剂SH-4-54来抑制STAT5通路活性，研究其对Huh7细胞放化疗敏感性的影响。结果发现，抑制剂抑制STAT5通路活性后，用5μM Sorafenib处理Huh7细胞可显著抑制细胞活力（99.00±4.58、64.33±6.51、51.67±6.11、26.33±4.73；F=89.138，P=0.000）（图5A），且2Gy放疗照射后细胞克隆存活能力显著降低（99.67±7.51、77.00±5.29、57.00±2.65、37.00±6.00；F=67.989，P=0.000）（图5B），得到与沉默GRAMD1A一致结果，表明GRAMD10可通过STAT5通路来增加肝癌细胞对放化疗的抵抗作用。