赵立平教授趣谈肠道微生物：肥胖细菌狩猎记(1-3节)

老赵（上海交通大学赵立平教授）的开场词：

“2005年把肠道菌群的工作开始向肥胖聚焦时，我就坚信，一定会找到一些具体的细菌种类，它们在肥胖的发生中起着关键作用，或者促进肥胖，或者抑制肥胖。2012年，经过8年连续不懈的努力，我们终于把第一个这样的细菌验明正身。有了这个方法，会有更多的与肥胖直接相关的细菌被发现，并可以研究清楚这些细菌参与肥胖发生、发展的分子机理，为肥胖和相关代谢病的预防和治疗提供新的靶点。”

“这是人类第一次实验证明：人体肠道里有的条件致病菌的确有引起肥胖的能力，它们在肥胖症患者肠道里过度生长是肥胖的原因，而不是结果。”

该论文以开放获取模式发表，欢迎免费下载。

肥胖细菌狩猎记（一）

肥胖像野火一样在全球蔓延，已成为一大健康公害。美国CDC把肥胖率超过30％的州用红颜色标注，放眼望去，美国已是“江山一片红”。中国也不甘落后，上世纪80年代以来，肥胖率如坐上火箭一样直线上升。今日的中国，无论是农村，还是城市，大腹便便的成人和儿童已比比皆是。

2010年3月，我在太原做肥胖人群营养干预试验，晚上在宾馆看报纸，一眼看到山西晚报上登的一张照片，一位很胖的小女孩在称体重，旁边的标题很醒目，2岁女童重达83斤，谁来帮帮她？看完新闻，我感到非常沉重。如此肥胖的女童，就是在肥胖大国美国也是非常罕见的呀？可怜的孩子她到底是怎么啦？据孩子妈妈介绍，这位小“胖丫”出生体重8斤左右，但在5个月后开始“疯长”，一岁时就有40多斤了，两岁时就超过了80斤。一年增加差不多40斤，这是何等的生长速度。是什么力量推动着这个幼小的身体在拼命地合成和积累脂肪呀？

长期以来，肥胖研究界占统治地位的理论是“热量学说”，认为现代社会的人摄入的热量太多、消耗的太少，能量不平衡，多余的热量成为脂肪存储起来，就导致体重不断增加，严重的就成为肥胖症。按照这个理论，减肥的主要办法是减少热量的摄入、增加运动量。但是，对于前面说到的这位小“胖丫”，减少热量摄入很难。她每天睁开眼睛就要吃东西，饥饿感非常强烈，明明刚吃了一顿，很快又叫饿。看着孩子饿得可怜巴巴的样子，家长哪里能忍心不让她吃呢？目前的减肥食谱要么通过去掉脂肪，要么通过去掉碳水化合物来降低热量，这种营养不平衡的膳食，对于一个正在快速发育的孩子显然是不合适的。“胖丫”静止时候的心律已经超过每分钟110下，两条小腿不堪重负已经弯曲，走路不超过10分钟就嚷嚷腿疼，因此，让胖丫通过增加运动量来减肥显然行不通。

怎么办？用什么办法能救救这样的孩子？

胖丫是不幸的，小小年纪就患上这样严重的肥胖症 。

胖丫也是幸运的。2004年到2009年，我开始研究肠道菌群与肥胖的关系，并摸索出一套膳食干预方法，首先在自己身上取得成功，健康减重40斤。2009年到2010年，我们进行了大规模的临床研究，并令体重350斤的重症肥胖患者减重103斤，身体各项指标恢复正常。这些研究正好在我见到她时取得实质性进展，使我们能够揭示出她患病的原因，而且安全、有效地帮她把体重从92斤减到了60斤，血压、血脂、胰岛素抵抗等各种生理指标恢复正常。孩子可以去上幼儿园了。

认识到肠道菌群与肥胖的关系就是我们可以帮助胖丫的理论基础。

2004年，美国华盛顿大学的戈登教授领导的研究组在美国科学院院刊上发表一篇研究论文，指出肠道菌群可以调节动物的脂肪存储。这是肠道菌群与肥胖研究的开山之作。他们是用无菌动物做的试验。通过无菌接生、在无菌环境里用无菌饲料来饲养，科学家能够培育出身体里没有任何微生物的小鼠。如果菌群在动物的脂肪合成、存储、利用中有自己的作用，无菌小鼠就会与有菌小鼠在肥胖症的发生中有不同的表现。

戈登教授的研究组用无菌小鼠做了很有意思的研究，他们发现，B6自交系无菌小鼠回接了正常菌群以后，身体内积累的脂肪比无菌时增加了57％，但进食量反而减少27％。当用NMRI自交系做同样试验时，结果更加惊人：“有菌化”以后的小鼠比无菌时的体内总脂肪量增加90%，进食量减少31%。也就是说，有菌群以后，小鼠吃得少了，积累的脂肪却多了，说明菌群有可能可以帮助动物更有效地从食物中吸收热量变成脂肪存起来。

更有意思地是，他们发现小鼠肠道里有一个基因fiaf，编码一种叫做“饥饿诱导的脂肪因子”的蛋白质，在动物饥饿时，这个基因表达出的蛋白质可以减少脂肪存储，增加脂肪的利用。无菌动物的fiaf基因是一直在表达的，不需要饥饿的诱导，因此，无菌动物不能积累脂肪。甚至给无菌动物吃高脂饲料，它们也不会肥胖，就是这个道理。不过，把fiaf基因单独破坏了以后，无菌小鼠吃高脂饲料以后就可以变胖了，说明fiaf基因在动物肥胖的发生发展中的确有重要的作用。

戈登他们发现，无菌动物有菌化以后，fiaf基因的活性就被抑制了，小鼠开始积累脂肪，而消耗脂肪变得更加困难，更有甚者，有菌化以后，小鼠肝脏里合成脂肪需要的基因的活性明显提高。换句话说，无菌小鼠有了菌群以后，身体受到菌群的控制，开始走上容易合成和积累脂肪、不容易消耗脂肪的代谢通路。戈登小组后来把肥胖小鼠的菌群接到无菌小鼠里，发现比来自健康小鼠的菌群更能够促进脂肪的积累。戈登实验室这一系列的工作令大家相信，肠道菌群在小鼠肥胖症的发生发展中可能具有非常重要的作用。后来，戈登实验室把肥胖患者的菌群移植给无菌小鼠，也发现可以比移植了体重正常的同卵双胞胎的菌群的小鼠体内积累更多的脂肪，证明人体肠道菌群作为一个整体也具有促进脂肪积累的作用。不过，需要指出的是，这些菌群移植的实验只是证明来自肥胖动物或者人的菌群比来自瘦的对照的菌群可以促进更多的脂肪积累，并没有真正引起受体动物肥胖。很多科普文章里说来自肥胖个体的菌群能让无菌受体小鼠肥胖是错误地夸大了戈登他们的实验结果。

2004年戈登的菌群调节脂肪存储的论文发表以后，学术界开始关注肠道菌群与慢性病的关系。以法国农科院著名的微生物基因组学家俄利锡教授为代表的科学家提出应该像测定人的基因组一样，组织一个大的计划把人体共生微生物的基因组序列测定出来，这是理解共生微生物与人体健康的基础。2005年4月，我在德国斯图加特大学施密德教授那里访问时，遇到了同时在那里讲学的法国工程院院士莽松教授。中午吃饭时，大家谈到了肠道菌群与健康的关系的重要性，他知道我也在做肠道菌群的研究后，就告诉我，法国农科院正在计划组织一个国际圆桌会议，要讨论推动人类微生物组计划的事情。他是组委会成员，因此，他希望提名我代表中国参加会议，我欣然接受了他的邀请。

2005年5月，我应西蒙乃教授邀请，参加在法国里昂召开的欧洲细菌遗传学与生态学会议并作主旨报告。会后，我顺道去图卢兹访问了莽松教授。然后到巴黎拜访了俄利锡教授，并通过他认识了肠道菌群研究领域很有名气的多海教授（有一个肠道细菌属就是用他的名字命名的）。这是我第一次去巴黎，周末在巴黎游览时，我在巴黎圣母院后面的桥上留了个影。那时的我腰围3尺3寸，看上去依然是大腹便便的样子。

2005年10月，在俄利锡等人的努力下，国际人类微生物组圆桌会议在巴黎召开。共有13个国家的科学家参加了这次会议。中国参加会议的除了我，还有杨焕明教授派出的代表。会议经过热烈的讨论后，提出“巴黎声明”，呼吁国际力量联合起来，启动对人的共生微生物进行测序的“人类微生物组计划”，因其规模实际超过人类基因组计划，对人体健康的意义可能一点也不亚于人类基因组计划，因此，国际社会开始称之为“人的第二基因组计划”。在这次会议上，大家多次谈到戈登教授发现肠道菌群与肥胖关系的论文，都一直认为这是说明肠道菌群对人体健康重要性的最有力的证据之一。会议期间，摸着自己的大肚子，我暗暗问自己，我的肥胖与细菌是不是有关系呢？

2005年11月，经过一年多的筹备，陈竺院士担任院长的“上海系统生物医学研究中心”成立。我当时作为常务副院长，张罗各种筹备事务。在成立大会结束时，我站在门口送大家，瑞金医院的宁光教授笑呵呵地拍着我的大肚子说，立平，你要减肥啦，否则，咱们合作搞糖尿病研究，自己将来得了糖尿病怎么办？怎么说服别人呀？我赶紧笑着告诉他，我要拿自己做试验，看看改变肠道菌群到底能不能减肥。这一年9月，我有4位博士生入学，全是女孩子。长得小巧玲珑的张晨虹说她愿意做肠道菌群与肥胖的关系，于是，我就有了第一位做肥胖与菌群关系的博士生。

2006年这一年，我们试着开始做动物试验。在贾伟教授实验室做中药与糖尿病关系的动物实验里，我们采集粪便样品，做些菌群结构的分析。这时的分析方法主要是一种叫变性梯度凝胶电泳的方法，只能检测出丰度超过1％的优势菌。而且，由于跑到同一个位置的条带序列可能不一样，因此，做不同样品的横向比较不够准确，需要结合每个条带的测序鉴定才行。这样做菌群分析，速度慢，通量低，每次能分析的样品数有限。因此，进展很慢。另外，我们申请的国家863项目没有获得批准，一下子实验室进入揭开不锅的状态，好在系统生物医学研究院从筹备经费里给我一点支持，这才苟延残喘，勉强支撑下去。

2006年6月，陈竺院长访问巴黎时，法国农科院院长贵瑶女士特意邀请他到院部会谈，专门商量如何推动两国在肠道菌群研究领域的合作。回国以后，陈院长请人类基因组南方中心的执行主任赵国屏院士和我们一起推动项目的进展，中科院营养所的前所长史香林和后来的所长陈雁教授，也参与项目的组织。

在次期间，有幸认识了法国农科院的两位“干部”，一位是法国农科院住北京办事处的负责人李正先生，一位是法国农科院负责营养学研究的局长亚威博士。他们从管理的角度竭尽全力地推动这个合作项目的进展。2006年7月，我接到亚威博士从巴黎打来的电话，说当时的总统希拉克将于10月份最后一次访华，法国农科院正在联系法国外交部，希望把中法肠道菌群研究列入中法国家间的科技合作协议里。他说法国外交部已经同意，并会积极与中方磋商。中国负责此类事务的是科技部国际合作司，具体负责处理的是欧洲处的邢处长。我专门到北京向邢处长汇报了项目的情况。虽然不是生物医学专业出身，邢处长却敏感地感觉到，肠道菌群研究非常重要，应该大有前途，表示会大力支持。在陈竺院长、赵国屏老师的指导下，我和陈雁起草了有关的项目说明和报告，送到科技部，开始了推动肠道菌群进入中法科技合作协议的努力。中法双方的各级领导都在积极地推动，特别是法国新任驻华大使，可能接到了法国外交部的指令，不遗余力地与中国科技部领导沟通。终于在最后一刻，“中法肠道元基因组合作声明”被列入中法政府利用希拉克访华的机会签署的14个协议中。李正先生作为北京办事处主任在我们与法国农科院、中国科技部和法国领事馆的沟通中发挥了积极的作用，也为我们多次赴巴黎与农科院同事协商项目事宜提供了申请签证的方便。亚威局长作为法方负责推动人类微生物组研究的领导，在协调中法合作协议签署和推动欧盟为肠道菌群与肥胖和炎性肠病关系研究立项方面立下汗马功劳。2007年欧盟第七框架能出资1千2百万欧元支持肠道菌群研究，与亚威局长的工作是分不开的。这个项目就是后来著名的MetaHIT计划。可惜的是，亚威局长后来身患结肠癌，不幸英年早逝，令人痛惜不已。法国农科院以他的名字命名了一座新的实验大楼，这栋大楼主要是为法国农科院研究营养和菌群关系的实验室准备的，是对亚威局长为人类微生物组计划所做贡献最好的纪念。

2007年元月，亚威局长带领法国农科院代表团访问上海交大，双方联合召开了中法肠道元基因组研讨会。这次会议，标志着中法肠道菌群研究合作的开始。我是中方的负责人，多海博士是法方的负责人。这一年，在连续申请7年之后，我们实验室终于成功申请到国家自然科学基金重点项目。科技部和上海市科委也从国际合作重点项目支持了中法合作；863计划生物信息主题也给了交大2个重点项目。有了这些经费，我们的工作开始进入快车道。

就在这一年，国际上对肠道菌群与肥胖关系的研究出现了一个令人振奋的新的进展，这就是所谓“代谢性内毒素血症假说”的提出。

肥胖的动物，除了能高效地合成和积累脂肪以外，还表现出一系列的代谢受损的症状，其中最重要的是胰岛素抵抗。我们知道，胰岛素抵抗是因为炎症因子破坏了胰岛素受体造成的。肥胖症的小鼠和胖人一样，身体里有一种低度的、全身性的慢性炎症。正是这种慢性炎症不仅破坏胰岛素受体，造成胰岛素抵抗，而且破坏血管，造成大小血管病变。这种炎症是怎么来的？是什么因素在不断刺激白细胞，使他们一直处于发炎的状态，不断产生炎症因子破坏人和动物的身体呢？

2007年，当时在法国医科院做博士后、现就职于比利时天主教卢文大学的卡尼和他的合作者的一篇论文，把大家的目光再次聚焦到肠道菌群与炎症的关系上来。

在这篇发表在糖尿病领域的顶尖杂志《糖尿病》的论文中，卡尼他们发现，用高脂饲料饲喂正常有菌群的小鼠，8周以后，小鼠出现肥胖和胰岛素抵抗的症状。这时的肥胖小鼠血液里，一种叫做内毒素的肠道细菌产生的毒素的浓度比健康对照升高2－3倍。这样的低浓度虽然只有急性感染时的50－100分之一，但已足够刺激全身的白细胞处于低度的炎性状态。因此，来自肠道菌群的内毒素可能是引起肥胖小鼠全身性低度炎症的重要因素。

为了证实这个假说，卡尼他们从希格玛化学公司购买了一种标准的内毒素——用一种大肠杆菌的细胞壁提纯出来的脂多糖成份。他们用一种注射泵，给吃普通饲料本来不会胖的小鼠持续皮下注射这种内毒素，剂量与肥胖小鼠血液里的内毒素浓度相当，这些小鼠开始出现低度炎症，最后变成肥胖小鼠，而且也有了胰岛素抵抗。看来，细菌产生的内毒素是引起动物肥胖的一个关键致病因子。

为了搞清楚内毒素引起的炎症在肥胖和胰岛素抵抗发生发展中的作用，卡尼他们做了进一步的试验。内毒素进入人或者动物体内后，会被一种叫做“脂多糖结合蛋白”的蛋白质运送到白细胞的表面，在那里与一种叫做CD14的受体结合，然后把信号传递到细胞内，刺激有关基因表达，令白细胞开始分泌炎性因子，进入发炎的状态。如果CD14受体被破坏了，白细胞就失去感知内毒素的能力，尽管血液里内毒素升高，它们也当作没看见，不会有反应，不会进入炎性状态。卡尼他们把低剂量的内毒素皮下注射给CD14受体基因敲除的小鼠，结果没有观察到炎性反应的产生，也没有像普通野生型的小鼠一样产生肥胖和胰岛素抵抗。换句话说，内毒素注射引起肥胖症必须经过诱导炎症这一步。如果没有炎症的发生，肥胖症就不会发生。

卡尼他们把这种低剂量的内毒素进入血液引起低度的慢性炎症从而导致肥胖、胰岛素抵抗等代谢损伤的机制叫做“代谢性内毒素血症”，区别于肠道条件致病菌“移位”，从肠道进入血液和内脏引起的急性败血症。

这是国际学术界首次把肠道里产生内毒素的条件致病菌与动物的肥胖和胰岛素抵抗等代谢损伤联系在一起，而且强烈提示内毒素与肥胖症是因果关系。

这个结果发表以后，受到很多质疑，例如，有人认为他们用于诱导肥胖症的高脂饲料的脂肪含量过高，人的膳食中脂肪含量是达不到这么高的，因此，这个工作对人类肥胖症研究意义不大。

作为一名从1983年进入研究生学习就研究细菌的人，看到卡尼的这篇论文，我感到非常兴奋，当天晚上几乎没有睡好觉。结合我读到的有关冠心病人等人体血液里发现细菌内毒素升高和有炎症的各种论文，一幅图像开始清晰地呈现在我的脑海里：肠道里有些可以产生内毒素的细菌可能就是肥胖症的致病因素。我们需要把这种细菌找出来，证明它们可以引起肥胖。这应该是接下来我们的工作重点。

在人类传染性疾病研究领域，要证明某种因子是引起某种疾病的原因，需要遵循“科赫法则”。所谓“科赫法则”是1876年由德国医生科赫在研究动物炭疽病的致病菌时发展出来的一套“证明某种细菌是引起某种疾病的病因”的研究规则。

科赫用显微镜观察得炭疽病死亡的动物的标本，发现血液里都有一种杆状的细菌。他据此提出，这种细菌可能是引起炭疽病的原因。但是，有人指出，得病的动物体内出现这种病菌也可能是得病以后的动物身体有利于这种细菌的生长，因此，血液里出现大量这种杆菌很可能只是发病的结果而已。科赫接着把病死的动物的血液接种到健康的动物体内，结果健康的动物开始发病死亡，而且血液里也出现看上去一样的大量这种杆菌，因此，这种杆菌可以传染这种疾病，它应该是致病的原因。人们又质疑说：血液里有各种各样的物质，直接用病死动物的血液接种，不能说明是这种杆菌引起了疾病，也许是某种用显微镜看不到的、未知的东西导致了疾病的发生。科赫随后发明了一种培养基，从血液里把这种杆菌分离出来，经过反复传代培养，得到了一种纯的培养物。然后，他把这种纯培养的细菌接种给健康的动物，发现它们都得了典型的炭疽病。从得病死亡的动物血液和组织里，他又分离出纯的杆菌，经过比较，与原来接种给健康动物的是同一种细菌。这个用纯培养的细菌令健康动物患病的试验才“一槌定音”，确认了炭疽病是炭疽杆菌引起的结论。这是人类第一次证明传染病是病菌引起的，把疾病的预防和治疗带入了一个新的时代。这是人类能够有效地控制传染病的开始。

科赫法则经过一百多年的风风雨雨，做了很多的修改，并不是因为规则本身有错，主要是在很多疾病病因的研究中，由于技术能力的限制，完全满足原来的科赫法则是非常困难的。例如，有很多病菌或者病毒不能被分离培养；有的病菌接种到健康动物很难发病，因为，除了要有病菌，很多疾病的发生还需要合适的环境条件，或者只有当动物的免疫力低下时才能发病。还有，人类的很多疾病找不到合适的动物模型，即使有了可疑病菌的纯培养物，也没法子做回接造病试验。而对于非传染性的慢性病来说，由于病因很复杂，用科赫法则来证明病因更是困难重重。尽管如此，科赫法则依然是证明某种因素是引起某种疾病的黄金法则，慢性病也不例外。在无法完全满足科赫法则的情况下，我们也要尽量满足科赫法则那种内在的、严谨的逻辑的美，为自己的结论提供尽可能多的各方面的证据。例如，证明吸烟与肺癌的发生有直接关系，就是在遵循科赫法则的逻辑框架的前提下，主要用大量的流行病学的证据来达成这一结论的。

1976年，正值科赫法则发表一百周年之际，耶鲁大学的伊文思教授发表文章，系统总结了从科赫法则提出以来，为了寻找包括传染病和非传染病在内的人类各种疾病的病因医学界所作的不懈的努力。

简单说来，要证明某种因子是引起人类某种疾病的致病因素，需要提供三个方面的证据：

1）相关性证据：病人有这个因子，健康人没有，或者，病人这个因子多，健康人少；同一个人，健康时没有这个因子或者数量少，得病了，就有了这个因子，或者这个因子数量增加；想办法减少或者清除这个因子，病人的疾病症状会减轻或者消除。

2）疾病复制证据：把因子纯化出来，转移到一种模型动物中，创造合适的条件，使动物发生与人体疾病类似的症状，也就是在动物中把疾病复制出来。

3）发病机制证据：用分子方法详细研究从这个因子数量增加到宿主最后发病的每一个步骤，用分子生物学和生物化学的方法从细胞到整体把因果链串起来。

有了这三方面的证据，这种因子是引起这种疾病的病因的结论就比较可靠了。

戈登和卡尼他们的工作，其实也是在遵循科赫法则的要求，尽量为“肠道菌群是引起肥胖症的重要因素”这个假说提供有力的证据。

但是，无论是戈登他们发现肠道菌群可以扰乱脂肪代谢基因的表达，还是卡尼他们发现肠道里条件致病菌产生的内毒素可以引起肥胖症，都有一个根本问题没有解决：在肠道里生活的上千种细菌中，到底哪些种类真正与肥胖症的发生、发展有关系？

肠道菌群结构非常复杂，到底怎么做，才能把与肥胖症发生、发展相关的细菌找出来呢？只有找到了与肥胖症相关的细菌种类，才有可能去分离它们、做疾病的复制试验以及致病机理试验，提供细菌引起肥胖的确切证据！

因此，把与肥胖症发生、发展有关的细菌种类鉴定出来，这是肠道菌群与肥胖关系研究领域面临的第一个挑战。这也是用科赫法则研究肠道细菌对肥胖贡献的三大步骤中的第一步：相关分析。

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肥胖细菌狩猎记(二）

人的肠道里生活着成百上千种细菌。它们与肥胖发生、发展的关系可以分成三类，一类细菌与肥胖成正相关的关系，也就是说，肥胖的症状越重，肠道里这类细菌的数量也就越多；第二类细菌与肥胖成负相关，即，肥胖的症状越轻，肠道里这些细菌就越多；第三类细菌的数量与肥胖的症状没有相关性，它们有时候在肥胖人的肠道里多，有时候在健康人的肠道里多，变化是随机的，没有什么规律。2004年戈登实验室在找到肠道菌群作为一个整体可能参与了肥胖发生、发展的证据以后，就开始积极探索肠道菌群的组成特征与肥胖的关系的研究。 

2006年12月21日，戈登实验室在同一期Nature杂志刊登两篇论文，分别在小鼠和人体的肠道菌群中发现与肥胖相关的共同的特征：肥胖的人或者小鼠肠道菌群中，厚壁菌门相对类杆菌门的比例很高，换句话说，厚壁菌门的细菌多，类杆菌门的细菌少。这个比例后来在有关论文里常被简称为F／P比值。他们发现，无论高脂饲料诱导的肥胖小鼠，还是瘦素基因缺失的遗传性肥胖的小鼠，其肠道菌群中的F／P比值都比健康的瘦的小鼠高。他们也发现肥胖症患者肠道菌群的F／­B比值也比健康人高，当肥胖患者通过低脂肪或者低碳水化合物饮食减肥以后，F／P比值回逐步降低到与健康的瘦的志愿者一样的水平。

这个发现发表后，引起了广泛的重视，从那以后，很多课题组在与肥胖有关的研究中，如果要测定菌群结构，都开始关注F／B比值，有的干脆就用定量PCR的方法直接测定这两个门的比例，而不再关注肠道菌群的精细结构在肥胖和瘦的个体间的差别了。

看到这个结果以后，我的第一个反应就是：这个结论是错误的。为什么呢？要理解这一点，我们需要复习一下本科微生物学课程里关于细菌分类的基础知识。

首先，我们知道，人这样的大生物是以“个体”作为基本的功能单位的，对大生物的分类就是把相似的个体归为一个分类单元。首先是把相似的“个体”归为一个“种”，然后把相似的“种”归为一个“属”，再把相似的“属”归为一个“科”，相似的“科”归为一个“目”，相似的“目”归为一个“纲”，相似的“纲”归为一个“门”。

细菌的基本功能单位叫做“菌株”。同一个菌株里的细菌的基因组序列是完全一样的。不同的菌株有至少一个碱基序列的差别，也可以有很多碱基序列不同。基因组的碱基序列差别越大，功能差别就越大。细菌象大生物一样，其分类也遵循：门、纲、目、科、属、种的从高到低的各级分类单元。“门”是一个很高的分类单元，目前地球上所有的细菌被分成70个左右的“门”，可见很多差别很大的细菌是被归在一个“门”里的。

把细菌的不同菌株划归成一个“种”是细菌分类的第一步，也是最关键的一步。但是，细菌的“种”的划分是一件比较困难的事情。在大生物世界里，“种”的划分有一个“金标准”叫做“生殖隔离”。马和驴虽然长得像，但是，它们是两个不同的“种”，因为它们之间杂交的后代骡子是没有生育能力的，这就叫生殖隔离。


可是，细菌之间非常容易交流基因，不存在这种明确的生殖隔离，因此，对细菌的“种”的划分，自打细菌被人类发现以来，就一直是一个争论不休的问题。一开始，微生物学家按照细菌是从哪里分离出来的，具体能做什么事情这样的所谓“表型”特征来对它们进行分类的。这样的做法，必然产生很多争议。记得我在读博士的时候，我们实验室有位博士生研究的两种植物病原细菌是按照能不能在39度生长来区分。她有一次做实验的时候，别的同学把她用的水浴锅的温度调成了37度，于是，那一批菌株就被“错误地”分成了另一个“种”了。

随着DNA分析技术的发展，细菌分类学家慢慢地开始用两个菌株之间的基因组DNA的相似性来进行“种”的划分。最后，大家终于达成一致，形成了如下的细菌划分“种”的标准：两个菌株之间的基因组DNA的相似性达到70％以上就被认为是“同一种”细菌；小于70％大于25％，被认为是同一个“属”里的不同“种”的细菌；小于25％就被认为是不同“属”的细菌。

单单这么说70％的基因组DNA相似性，大家可能对同一个“种”里的不同菌株的差别到底有多大是没有什么概念的。我们这么做个比较吧：人和小鼠的基因组DNA的相似性是90％；人和黑猩猩的基因组DNA的相似性是99％；人和人之间的基因组DNA的相似性是99.9％。换句话说，同一个种里的两个菌株的基因组DNA序列之间差别可以三倍于人和小鼠之间的差别！人和小鼠是多么不同的生物啊！同一个“种”里的不同菌株居然可以比它们之间的差别还可以大几倍！

肠道菌群虽然有上千种，但是，只有8－9个最常见的门。而厚壁菌门和类杆菌门合起来就占到总菌量的95％左右。把所有属于厚壁菌门的细菌合并在一起与所有属于类杆菌门的细菌求出一个比值，认为与肥胖的发生有关系，这里面隐含了一个不合逻辑的假定：所有属于厚壁菌门的细菌在肥胖时都增加，在减重后都减少，所有属于类杆菌门的细菌在肥胖时都减少，在减重后都增加。作为一个研究微生物生态多年的人，知道同一个门的细菌可以对环境条件的变化有非常不同的反应，有的会加快生长，有的则会放慢生长，有的可能不发生变化，想让它们齐步走是不可能的。
   
戈登教授在2006年那篇报道肥胖患者减肥以后F／B比值变得与瘦人一样的Nature论文的后面指出：这是第一次发现在“门”这样一个很高的分类单元里的不同细菌可以共享一种与宿主健康有关的功能。言外之意，下一步就是要把这个同一个门里的不同细菌都具有的“功能”找出来。当然，这也是最终确定F／B比值真的与肥胖有关系的最重要的证据。但时至今日，十年时间快过去了，这个“功能”也还没有找到。

后来，很多实验室也发表了F／B比值与肥胖关系的论文，有的支持戈登小组的结论，有的发现这个比值与肥胖没有关系，也有的报道是相反的关系。这些矛盾的结果提示我们，把F／B的比值作为菌群结构特征寻找与疾病的相关性，未免还是太粗线条了些。

如果把同一个属里的所有种都加到一起，我们就很可能把与疾病的发展关系相反或者没有关系的细菌都统统不分青红皂白地加到一起，然后去求与肥胖的相关性，无论是从微生物学还是从统计学的角度看，这样做都是错误的。至于把不同“属”归成一个“科”，或者用不同的“目”、“纲”乃至“门”的总数量来寻找与疾病的相关性，谬误之大就毋庸赘言了。

因此，考虑到同一个种里的不同菌株都可能具有非常不同的功能，我们在寻找与肥胖相关的细菌时，要努力地分析“菌株”水平的变化，如果做不到，也要尽可能在“种”的水平做分析。同一个种的不同菌株，会有一套基因是大家共有的，这个叫做同一种细菌的“核心基因组”，还有一些基因是只有一个菌株或者一部分菌株才具有的，合在一起叫做“泛基因组”。如果与肥胖相关的功能是一种细菌的核心基因组编码的，这个种里的所有菌株都会具有这个功能，这样，检测这种细菌的数量，就可能得到与肥胖症状严重程度的很好的相关性。但是，如果与肥胖相关的功能是泛基因组编码的，只是一部分菌株才有的，用检测这种细菌数量的办法来寻找与肥胖的相关性就会出现偏差。努力在“种”和“菌株”的水平寻找肠道细菌与肥胖的相关性成为解决问题的关键。

怀疑归怀疑，没有实验证据是很难对这个结论提出挑战的。虽然在公开场合不适宜质疑这个结论，但我心中有数，不能太把这个结论当回事，要继续走自己的路，在实验室内部的组会上或讨论课题时，我经常提醒学生们，要保持头脑清醒，别被Nature发表的结论吓糊涂了，走入歧途。 {nextpage}

肥胖细菌狩猎记(三）
可是，走自己的路谈何容易。科学家都是在黑暗中摸索前进的，要想走得快、不摔交、不迷路，除了要有清醒的头脑，还得有得力的工具才行。“工欲善其事，必先利其器”，能够让我们在种合菌株水平研究肠道细菌与肥胖关系的工具到底在哪里啊？

要找到与肥胖相关的细菌，可以采用两个策略：一个是横断面研究，就是比较肥胖病人的肠道菌群与健康人的差别，另一个是纵向跟踪式的研究，就是监测同一个个体在从健康到肥胖或者从肥胖到健康的过程中菌群结构的变化，看哪些种类总是在肥胖的个体里多一些或者在健康的肠道里多一些。做这种相关分析，需要两个技术非常过关，第一，必须能把肠道样品中的几千种细菌的丰度测定出来；第二，必须用多变量统计方法去处理数据，把与肥胖相关的菌群结构模式找出来。

自打科赫分离出炭疽杆菌的纯培养物，证明了传染病是细菌引起的以后，分离细菌，得到其纯培养物成了研究细菌的标配技术。自微生物学创立后的很多年里，分离不出一种细菌，就没有办法研究它。不过，科学家发现，用显微镜直接从环境样品里能观察到的细菌数量与通过分离培养得到的细菌数量之间有很大差别，这意味着，自然界里的细菌有很多用现有的技术没办法分离出来，也就不能加以研究和利用。

人的肠道菌群也一样，有很多种类是用现有的技术分离不出来的，因此，没有办法用经典的微生物学技术进行测定。另外，通过在培养基上的生长数量来测定一个样品里某一种细菌的数量，准确性也是很差的。差到什么程度呢？差别大于一个数量级，也就是差别超过10倍，才能有把握地说两个样品里这种细菌的数量有差别。很显然，依靠分离培养的方法研究肠道菌群的变化与肥胖的关系是一个非常困难的任务。

解决这个问题的曙光，出现在上个世纪80年代初。卡尔沃兹教授用一个叫做核糖体小亚基RNA的基因的序列来研究地球上细胞生物的进化关系，发现，细胞生物可以分成细菌、古菌和真核三大“域”。细菌和古菌是我们常说的微生物的主要类型。而真核生物包括了植物、动物和人类。这个基因之所以能够用来对所有的细胞生物进行分类，是因为它符合所谓“进化指针”的条件：1）所有的细胞里都有这个基因；2）这个基因在所有细胞里的功能都是一样的，是合成蛋白质必需的；3）由于是细胞活下去离不了的基因，因此，很多位置不能发生序列的突变，有了突变，细菌不能合成蛋白质，就死掉了，不会留下后代。能够留下后代的细胞，只在这个基因的不太重要的区域会积累突变，这些区域叫高变区。高变区的序列变化是与细胞生物进化的速度相当的。这些区域的序列差别越大，表明两种生物的亲缘关系越远；4）这个基因在所有细胞生物里的序列都有大约80％左右是一样的，通过对多个生物的这个基因序列的比对分析，可以定量地测出它们的序列差别，然后据此划出一个“进化树”，也就是可以做出这些生物的遗传家谱了。

细菌和古菌这些微生物的亲缘关系，可以用16SrRNA基因的序列进行测定和展示。经过对大量的数据的分析，大多数细菌学家同意用这个基因的大约1500个碱基的序列的相似性对细菌进行分类。如果这个基因的序列在两株细菌之间相似性大于97％，就可以认为它们是同一个种的细菌。目前，所有人类分离鉴定的细菌在正式定名之前，都需要测定16SrRNA基因的序列并与其他定种的依据一同发表。于是，国际上出现了专门收集细菌16SrRNA基因序列的数据库，最早也最有名的当属RDP，后来又出现了SILVA和Greengenes等数据库。如果你得到了一种未知细菌的16SrRNA基因序列，用它和数据库里的已知细菌的序列做比较，就可以大致知道其分类地位，这叫作“最近邻居分类法”，也就是，用与你的序列最相近的已知序列来对你的序列代表的细菌进行分类，或者对其分类地位做合理的猜测。如果你的细菌的16SrRNA基因序列与数据库里某种已知细菌的序列的相似性超过97％了，就可以初步定成与这个已知细菌属于同一个种，如果差得比较多，就看能不能定到更高的分类单元，属、科、目、纲或者门。

2005年人类微生物组巴黎圆桌会议宣布要做人体共生菌群测序时，我们实验室的主要工具是DGGE指纹图技术和克隆文库测序技术。

DGGE技术前面说过分辨率和通量都比较低，想做大量样品的比较是很难的。不过，我们实验室从博士生高平平、张学礼开始，用这个技术分析废水处理反应器的菌群结构，取得了很好的结果，张学礼甚至解决了一个从1993年DGGE技术用于微生物群落结构分析以来一致没能很好解决的单链DNA污染问题，并发表了一篇改进方法的SCI论文。我们实验室很快就成了国际上用DGGE技术分析菌群结构比较好的实验室之一。我们论文中的DGGE图谱干净、优美，审稿人一看就喜欢。不过，后来发现，国际上发表的DGGE图谱都开始有统计分析的结果。我们这一块成了短板。另外，用克隆文库通过测定16SrRNA基因多样性的方法测定菌群的结构也从少量样品的多样性测定，要开始向多个样品间的比较过渡。这类问题的特点是变量数远远大于样本数，需要用特殊的多元统计的方法进行模式识别，我们组里没有人懂得这个技术。

就在这时，一个很重要的人物登场了。她就是青年学者张梦晖。张梦晖2005年从比利时布鲁塞尔自由大学博士毕业，专业是化学计量学，专门是处理各种分析仪器产生的大量数据的模式识别问题。她的导师是这个领域的开拓者之一。张梦晖在上海找工作时，先找了我的老搭档贾伟教授。不过，药学院以编制紧张，一个组只能有一个助手为由，回绝了贾伟的进人申请。贾伟给我打电话，问是不是可以让张梦晖进生命学院。一听这个求职者的背景，我大有如获至宝的感觉。立马去请示罗九甫书记，是否可以把张梦晖进到我的组里，尽管我的组里青年教师已经比较多了，罗书记了解到张梦晖对我们工作的重要性后，非常支持，表示可以给编制。这样，我就把张梦晖约到我在徐家汇的办公室见面，谈了10分钟，就告诉她可以办入职手续了。对于这么顺利进交大，张梦晖当时挺感到意外，不过，现在她该明白为什么了。

张梦晖来了以后，把多元统计方法用到DGGE图谱和克隆文库数据的模式识别上，给我们带来了很多新的进展。

当时，国际上已经开始出现454焦磷酸测序这样的高通量测序的工作，可以一次获得多个样品的DNA序列多样性测定结果。如何对多个样本的微生物多样性进行比较，找出有意义的差别，就成为一个很重要的技术瓶颈。张梦晖带着博士生张美玲，用PLS-DA和RDA这样的统计方法，对轮状病毒感染导致腹泻的儿童肠道菌群样品和健康对照的类杆菌属的克隆文库数据进行了对比分析，发现了与疾病相关的关键种类。这个工作发表到欧洲微生物学会联合会的微生物生态学杂志。虽然处理的数据不大，但却是有代表性的数据集，为日后我们处理规模比较大的454测序数据奠定了统计方法的基础。张梦晖自己觉着，这些统计学方法都是很经典的，对她来说没有什么难度。但实际上，把这些方法用到微生物生态学领域的DNA测序数据的处理，还是需要做些重要的改进和适应工作的。她带来的方法直到现在还是这个领域最好的方法之一。

虽然，我对戈登实验室F/B比值与肥胖相关的结论心存疑虑，但是，要说服自己和实验室的学生、老师，去寻找与肥胖相关的具体细菌种类，需要对肠道菌群与人体健康的关系先做一些深入的分析。要想办法看到肠道菌群里面的一些细菌种类对人的健康的影响比别的种类要更大。也就是说，要研究肠道菌群与人的健康的关系，就一定要具体分析不同种类的表现，而不能不分青红皂白，把很不一样的细菌合在一起，观察它们的行为。

454焦磷酸测序技术的出现，为解决这个问题带来了曙光。

454测序技术是新一代测序技术的代表之一。这个技术一次可以测定几十万条序列，每个碱基的测定成本大幅度降低，一台机器的测序能力抵得上100台老一代的桑戈测序仪。不过，要把这个方法用到菌群样品的测序，需要解决如何一次测定几百个样品还能把每条序列是从哪个样本来的分辨清楚的问题。

2006年8月，我到维也纳参加国际微生物生态学大会，在大会上被选为学会的常务理事。会议结束后，我去瑞典访问了詹森教授，她也是微生物生态学领域很活跃地做菌群的专家。在那里我了解到，当时已经有人把每个样品在做PCR扩增时，引物前面加一段特殊的标记序列叫barcode，有点像商品上的条形识别码。这样，就可以把几百个样品混在一起做一次454测序，然后把几十万条序列按照识别码的不同进行分配，最后，就可以一次拿到几百个样品的序列，每个样品可以测定上千条，足以用序列的多样性组成来反映样品里的微生物的种类组成。据他们讲，这个思路是他们最先提出来的，但还没有来得及发表，就被别人抢先了，很是郁闷。

得到这个消息，我长出了一口气，我们寻找肥胖细菌需要的技术终于具备了！接下来的任务，就是尽快通过做一个项目，把这个技术方法在我们实验室建立起来。

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