Nat Commun : JAK2V617F 的克隆造血促进肺动脉高压，肺中性粒细胞中 ALK1 上调
2021-10-29 刘少飞 MedSci原创
肺动脉高压是一种以肺动脉重塑为特征的进行性心肺疾病。临床研究发现 JAK2V617F 阳性克隆性造血在 PH 患者中比在健康受试者中更常见，会导致与ALK1 上调相关的肺动脉高压的发展。
肺动脉高压（PH）是一种复杂的心肺疾病，其特征是肺血管阻力和肺动脉压力增加。 尽管最近在诊断和治疗方面取得了进展，但 PH 仍然是一种严重的疾病，最终会导致具有高死亡率的右心衰竭。PH 的病理特征是小肺动脉的结构重塑，这与内膜增厚、肌肉化和丛状病变的形成有关。 骨髓 (BM) 衍生的祖细胞以及血管周围炎症浸润有助于肺动脉重塑的过程。骨髓增生性肿瘤 (MPN)患者的 PH 发生率高于一般人群，并且在 MPN 患者中观察到因心血管疾病导致的高死亡率。根据 WHO 临床分类，PH 分为五个类。 基于上述观察，MPN 相关 PH 被归类为 WHO 第V 组（较少研究），这是一个重要的异质组，包含不清楚的多因素机制。
MPN 包括真性红细胞增多症 (PV)、原发性血小板增多症 (ET) 和原发性骨髓纤维化 (MF)，其特征是成熟骨髓细胞的慢性增殖，而骨髓增殖表型是由 JAK2、CALR 和 MPL 的体细胞突变驱动的。在 MPN 中，JAK2V617F 是 JAK2 中的一种激活体细胞突变，是最常观察到的驱动突变； 它已在超过 95% 的 PV 患者以及 50-60% 的 ET 和原发性 MF 患者中观察到。 JAK2V617F 导致 JAK-STAT 通路的细胞因子非依赖性激活，导致成熟髓细胞增殖。
MPN 患者常表现出静脉和动脉血管并发症。特别是，与具有其他驱动突变的患者相比，具有 JAK2V617F 的 MPN 患者显示出更高的血管并发症发生率。然而，克隆性造血与 PH 中 JAK2V617F 的机制相关性尚未阐明。
研究设计思路：
为了了解 JAK-STAT 通路在 PH 发展中的参与，将成年野生型 (WT) C57BL/6 J 小鼠暴露于慢性缺氧 (10% O2)，全肺匀浆而非分离细胞上的 STAT3 磷酸化水平显着增加，表明 JAK-STAT 激活可能在慢性缺氧诱导的 PH 中发挥病理生理作用。
为了阐明 JAK2V617F 表达对 PH 发病机制的影响，该研究使用了 Jak2V617F21 在暴露于常氧或慢性缺氧后转基因表达 Jak2V617F21 的雌性小鼠。在常氧暴露后，与 WT 同窝仔鼠相比，JAK2V617F 小鼠的白细胞和血小板计数显着更高，表明 JAK2V617F 小鼠的 MF 样表型。JAK2V617F 小鼠表现出肺血管重构，伴随着慢性缺氧后肺血管周围中性粒细胞浸润增加。
该研究接下来研究了造血细胞克隆，检测是否通过 BM 移植（BMT）促进了 PH 的发展。将来自 JAK2V617F 小鼠或对照 WT 小鼠的供体 BM 细胞注射到经致命辐射的受体 WT 小鼠中，以便受体小鼠具有 WT 肺。值得注意的是，与其他组相比，响应慢性缺氧的 JAK2V617F-BMT 小鼠肺中的弹性蛋白酶活性、中性粒细胞相关趋化因子和趋化因子受体以及细胞因子显着升高。
为了在肺动脉重塑中对携带 JAK2V617F 的 BM 衍生造血细胞进行可视化和进一步表征，该研究通过将 JAK2V617F 小鼠与 CAG-EGFP 小鼠杂交产生了双转基因小鼠（JAK2V617F/CAG-EGFP 小鼠）。将来自 JAK2V617F/CAG-EGFP 小鼠或对照 WT/CAG-EGFP 同窝仔鼠的 BM 细胞移植到经致死照射的 WT 小鼠中。在 BMT 暴露于慢性缺氧 3 周后，免疫染色显示 GFP+ 细胞在移植了来自 JAK2V617F/CAG-EGFP 小鼠（JAK2V617F-GFP-BMT）的 BM 细胞的 BMT 受体的肺动脉区域中大量积累。
接下来使用不同比例的 WT-GFP 或 JAK2V617F-GFP BM 细胞和没有 GFP BM 细胞的 WT 的混合物进行了竞争性移植。在对照非竞争性组中，流式细胞术显示，与 100% WT-GFP-BMT 和 100% JAK2V617F-GFP- 4 周时相比，血液中 CD45+ 细胞内 GFP+ 细胞评估的嵌合现象在 8 周时显着升高。
接下来研究从 WT-GFP-BMT 和 JAK2V617F-GFP-BMT 小鼠的肺和血液中分离出细胞部分，在 BMT 后 8 周具有 1-19% 的嵌合现象。 JAK2V617F-GFP-BMT 小鼠 Ly6G+ 中性粒细胞中 GFP+ 细胞的百分比在肺中显着高于血液中，而 WT-GFP-BMT 小鼠在肺和血液中的百分比没有差异。为了阐明携带 JAK2V617F 的 BM 衍生的中性粒细胞如何与 PH 发展有因果关系的潜在机制，通过 RNA 测序在来自 BM、外周血 (PB) 和肺的分选 Ly6G+ 细胞中对中性粒细胞的几个分化阶段进行了基因表达谱分析JAK2V617F 小鼠与 WT 小鼠的比较。基因集富集分析显示，与 WT 小鼠相比，JAK2V617F 小鼠中性粒细胞分化的每个阶段的经典 IL6-JAK-STAT3 通路均上调。
为了研究 JAK2V617F 对 ACVRL1 的调控机制，分析了杂合 JAK2V617F 敲入 (JAK2V617F/+) HCT116 细胞系。与 JAK2+/+ 细胞相比，JAK2V617F/+ 细胞中 STAT3 的磷酸化水平显着升高。
该研究分析了 ALK1 的抑制是否可以改善 JAK2V617F 小鼠中慢性缺氧诱导的 PH。 K02288，一种 ALK1/230,31 的化学抑制剂，明显降低了慢性缺氧暴露的 JAK2V617F 肺以及 JAK2V617F/+ HCT116 细胞中 Smad1/5/8 的磷酸化水平。为了阐明 PH 中 JAK2V617F 克隆造血的临床相关性，该研究前瞻性地招募了 PH 患者，并通过等位基因特异性定量 PCR 分析检查了 70 名 PH 患者中 JAK2V617F 克隆造血的患病率 。引人注目的是，我们发现 7.1% 的 PH 患者（n = 5）在外周白细胞中显示 JAK2V617F 体细胞突变，显着高于年龄和性别匹配的对照受试者。这些数据表明，无论血细胞计数或 PH 严重程度如何，JAK2V617F 的克隆造血与该突变体携带者中 PH 的发生和发展有关。
文章出处：
Kimishima Y, Misaka T, Yokokawa T, Wada K, Ueda K, Sugimoto K, Minakawa K, Nakazato K, Ishida T, Oshima M, Koide S, Shide K, Shimoda K, Iwama A, Ikeda K, Takeishi Y. Clonal hematopoiesis with JAK2V617F promotes pulmonary hypertension with ALK1 upregulation in lung neutrophils. Nat Commun. 2021 Oct 26;12(1):6177. doi: 10.1038/s41467-021-26435-0. PMID: 34702814.
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