【期刊导读】郑琦/江家骥教授：慢乙肝患者接受聚乙二醇干扰素α治疗有助于HBsAg特异性B细胞耗竭表型的恢复

编者按

聚乙二醇干扰素α（PEG IFNα）作为一种免疫调节剂，是当前慢乙肝治疗的主要药物之一。随着相关机制的深入探索，已有多项研究表明B细胞在其中发挥了重要作用。

近日，福建医科大学附属第一医院的郑琦教授和江家骥教授团队在Journal of Hepatology上发表了关于慢乙肝患者接受PEG IFNα治疗过程中HBV特异性B细胞变化的相关研究，结果表明：在PEG IFNα治疗期间，HBsAg特异性B细胞耗竭表型被恢复，且活化细胞的频率增加，在临床治愈患者中其抗体分泌能力恢复，出现IgG⁺经典记忆B细胞；而HBcAg特异性B细胞频率降低，其抗体分泌减弱。

研究背景

B细胞分泌的HBsAb具有中和活性，可通过细胞毒性和细胞吞噬来促进HBV感染细胞的清除。慢乙肝患者的HBsAg特异性B细胞富集CD21^-CD27^-非经典记忆B细胞（atMBC）表型，并表现出抗体分泌细胞成熟受阻及抗病毒功能受损，这与慢乙肝患者缺少HBsAb相一致。

与HBsAg特异性B细胞相比，HBcAg特异性B细胞占总体B细胞群中相对较高的比例，且以IgG⁺类转换CD21⁺CD27⁺经典记忆B细胞（cMBCs）为主要表型。这些亚群可以分化并成熟为浆细胞，获得增强的抗体分泌能力。

HBcAg作为一种B细胞超抗原，其独特结构可绕过传统的辅助T细胞应答途径。与HBcAg特异性B细胞不同，HBsAg特异性B细胞向浆细胞的成熟和分化需要滤泡辅助T细胞（Tfh细胞）。HBV感染中Tfh细胞功能受损是HBsAg特异性B细胞功能缺陷的原因。

研究方法

纳入39例接受核苷（酸）类似物（NUCs）序贯PEG IFNα治疗的慢乙肝患者、8例未治疗患者和3例接种乙肝疫苗的健康对照者。34例患者根据是否获得临床治愈分为CR（chronic resolved）组和非CR（NCR）组。

利用荧光标记的HBsAg和HBcAg对HBV特异性B细胞进行体外鉴定。采用流式细胞术检测HBV特异性B细胞和Tfh细胞的频率、表型和亚群。通过ELISpot法量化HBV特异性B细胞的功能。

研究结果

01 PEG IFNα可促进B细胞成熟为浆细胞

纵向队列纳入15例完成48周PEG IFNα治疗的慢乙肝患者。所有患者的HBsAg水平均有不同程度的下降，13例患者在治疗48周后HBsAg < 10 IU/mL，5例（33%）患者获得HBsAg清除，并在随访60 - 72周时获得HBsAg血清学转换。

在PEG IFNα治疗期间，总体B细胞中幼稚B细胞的数量增加，MBCs的数量在48周时呈下降趋势（图1A），但并未实质性地影响整体MBC的表型。此外，CD27^hiCD38^hi浆母细胞数量大幅增加（图1B），但总IgG表达量未增加，提示PEG IFNα促进B细胞成熟为浆细胞，但不足以增强其抗体分泌能力。

在PEG IFNα治疗期间，cMBCs的数量减少，CD21^-CD27^-atMBCs和CD21^-CD27⁺激活的记忆B细胞（actMBCs）的数量增加，但在48周时恢复至基线水平（图1C）。actMBCs和cMBCs的IgM表达下降（图1E），IgG没有变化（图1D）。各亚群中CD38的表达量均有所增加，并在actMBCs中达到最高水平（图1J）。

图1.慢乙肝患者接受PEG IFNα治疗期间外周整体MBC亚群的分布和表型

02 PEG IFNα治疗可提高HBsAg特异性B细胞分泌抗体的能力

在15例接受NUCs治疗的慢乙肝患者中，大部分患者（13/15）的基线HBcAg特异性B细胞频率比HBsAg特异性B细胞更高（图2B）。经过48周的PEG IFNα治疗后，HBcAg特异性B细胞的中位频率较基线下降，但仍高于配对样本中HBsAg特异性B细胞的频率（图2C、F，1.56倍，p = 0.0266）。

PEG IFNα治疗各时间点的HBsAg特异性B细胞的中位频率相似（图2D），并与血清HBsAg水平呈负相关（图2E）。

在获得临床治愈的患者中观察到，PEG IFNα治疗可提高HBsAg特异性B细胞分泌抗体的能力（图2H）。而HBcAg特异性B细胞的抗体分泌显著减少，且与HBsAg血清学转换状态无关（图2I）。

图2.在PEG IFNα治疗期间，HBcAg特异性B细胞的频率降低，而HBsAg特异性B细胞的频率保持不变

03 在PEG IFNα治疗期间，活化的HBsAg特异性B细胞频率增加

基线时HBsAg特异性B细胞中富集IgG^-atMBCs（图3B）。在PEG IFNα治疗过程中，actMBCs比例增加表明激活表型的上调（图3C）。低亲和力受体IgM表达降低，转换为高亲和力受体IgG（图3D）；IgG⁻atMBCs细胞分布减少，出现IgG⁺cMBCs和IgG⁺atMBCs（图3B）。此外，HBsAg特异性B细胞表面的CXCR3、CD38表达增加，而CXCR5的表达降低（图3E、F），出现浆母细胞（图3B）。

图3. PEG IFNα治疗恢复了耗竭的HBsAg特异性B细胞的功能

04 PEG IFNα治疗后，HBcAg特异性B细胞中富集表型减弱的atMBCs

基线时HBcAg特异性B细胞中富集IgG⁺cMBCs和actMBCs（图4A）。在PEG IFNα治疗期间，cMBCs频率降低，atMBCs频率增加（图4B）；IgG表达降低，IgM表达增加（图4C）；IgG⁺cMBCs的分布减少，IgG^-atMBCs的分布明显增加（图4A）。此外，CXCR5的表达逐渐增加（图4D）。虽然治疗后HBcAg特异性B细胞中CD38的表达增加，但这些细胞并非浆母细胞，而是IgM⁺CD38⁺atMBCs（图4A、E）。

图4. PEG IFNα治疗后，HBcAg特异性B细胞的变化

对治疗48周的患者HBsAg和HBcAg特异性B细胞进行配对分析。发现HBcAg特异性B细胞的cMBCs频率低于HBsAg特异性B细胞（图4G）。HBsAg特异性B细胞上IgG⁺的表达较高（2.88倍），而HBcAg特异性B细胞上IgM⁺的表达更高（图4H）。与HBcAg特异性B细胞相比，HBsAg特异性B细胞表达更高水平的CXCR3和更低水平的CXCR5（图4I）。在同一患者中，HBsAg特异性B细胞中CD69的表达较高（图4J）。

图4. PEG IFNα治疗后，与HBsAg特异性B细胞相比，HBcAg特异性B细胞受病毒抑制的影响免疫表型减弱

05 接受PEG IFNα治疗的慢乙肝患者与未治疗患者HBV特异性B细胞的免疫特征差异

纳入19例完成标准疗程PEG IFNα治疗的慢乙肝患者，并进一步评估不同治疗结局的患者HBV抗原特异性B细胞的免疫学特征。

1. HBsAg特异性B细胞

分析HBsAg特异性B细胞的HBsAb生产能力，发现CR患者的HBsAb阳性细胞（SFC）数量明显高于NCR和未治疗患者（图5A）。在CR患者中，HBsAb-SFC的数量与血清HBsAb水平有良好的相关性（图5B）。

与NCR和未治疗患者相比，CR患者的HBsAg特异性B细胞中cMBC数量更高，atMBC数量较低（图5D）。

与未治疗患者相比，治疗后HBsAg特异性B细胞中IgG和CD38的表达更高，而IgM和CXCR5的表达较低（图5E - G)。且与NCR患者相比，CR患者的IgG和CD38水平更高，IgM和CXCR5水平更低（图5E - 5F）。CR患者的IgG⁺cMBC和浆母细胞的比例高于NCR和未治疗患者（图5C），提示HBsAb分泌能力增强。

图5.未治疗（CHB）、NCR和CR患者中HBsAg特异性B细胞的差异

2. HBcAg特异性B细胞

与未治疗患者相比，PEG IFNα治疗后HBcAg特异性B细胞的HBcAb分泌均有所减少（图5H）。同时，actMBC比例降低，但仅在CR患者中具有统计学意义（图5I）。在NCR和CR患者中HBcAg特异性B细胞的IgG水平较低，IgM、CXCR5和CD38的表达较高（图5K、L），出现IgM⁺cMBC和IgM⁺atMBC亚型（图5J）。

图5.未治疗（CHB）、NCR和CR患者中HBcAg特异性B细胞的差异

06 PEG IFNα治疗期间，Tfh细胞的CD40L表达升高，并与HBsAg特异性B细胞的免疫激活相关

在PEG IFNα治疗过程中，Tfh细胞数量没有变化，但诱导共刺激分子（ICOS）的平均荧光强度降低（图6A、B）。同时，CD40L表达增加（图6C），CD40L⁺Tfh细胞频率与HBsAg特异性B细胞中actMBCs及激活标志物CD38和CXCR3的比例呈正相关（图6D）。

经PEG IFNα治疗后，调节性T细胞（Treg）频率显著增加（图6E），且Treg细胞中PD-1的表达量低于Tfh细胞（图6G）。滤泡调节性T细胞（Tfr）是B细胞和Tfh细胞之间的负调控亚群，在治疗后没有明显变化（图6H），表明在生发中心，Tfh细胞对B细胞的辅助功能可能未受到影响。

图6. CD40L⁺Tfh细胞与HBsAg特异性B细胞激活标记物相关，在PEG IFNα治疗期间Treg细胞频率增加

总结

• 临床治愈患者HBsAg特异性B细胞的抗体分泌能力恢复

• 临床治愈患者HBsAg特异性B细胞中出现IgG⁺经典记忆B细胞

• PEG IFNα治疗后，HBcAg特异性B细胞抗体分泌减弱，并出现IgM⁺非经典记忆B细胞

• CD40L⁺ Tfh细胞频率与HBsAg特异性B细胞的免疫激活状态有关

肝霖君有话说

虽然在许多慢乙肝患者中可检测到HBsAg特异性B细胞，但其表型和功能受损无法产生HBsAb，导致慢乙肝患者的HBsAg血清学转换率较低。已有多项研究表明，PEG IFNα治疗有利于B细胞亚群重塑，也可通过Tfh细胞刺激B细胞分化，促进HBsAg血清学转换。此外，IFNα可以B细胞依赖的方式协调保护性HBV特异性细胞免疫。

此前，郑琦教授团队于2023 EASL大会中发表相关摘要表明，在PEG IFNα治疗期间，HBsAg特异性B细胞的耗竭表型被恢复，而HBcAg特异性B细胞的应答显著降低。该研究的全文正式发表，阐明PEG IFNα治疗期间及临床治愈患者中HBV特异性B细胞数量、亚型及功能的变化。相信随着相关研究的不断深入，对于免疫学机制的理解也将逐渐明朗，有利于进一步推动慢乙肝临床治愈率的提升。

参考文献：  

Zhang JW, Lai RM, Wang LF, et al. Varied immune responses of HBV-specific B cells in patients undergoing pegylated interferon-alpha treatment for chronic hepatitis B[J]. J Hepatol, 2024.