液体活检大热点之CTC
2017-03-14 佚名 优迅医学
随着CTC分离和鉴定技术的发展，对于CTC的研究再次成为肿瘤领域的焦点。FDA批准上市了cellsearch掀起了新一轮的热潮。今天就带大家一起走进这个大热点。
近两年，ctDNA液态活检在肿瘤诊疗中的成绩可谓有目共睹，历次学术大会上专家都给予了的充分的肯定。但另一方面也表达了对液态活检的期望：ctDNA优势不少，但是复杂的变异情况，加之高昂的检测费用。使得研究阶段提出的疗效评价，病情监测等应该充分发挥液态活检取样优势的方面，却离临床应用总有一步之遥。
肿瘤液态活检的概念亦起源于CTC，相比ctDNA，发现最早却浮沉多年的CTC在几番打磨后逐渐发挥出自己的优势。CTC可是祖师爷级别的发现，与孟德尔种豌豆得出遗传定律大概是一个时期的事情。早在1869年，CTC在血液涂片中就已经被观察到了，但是是在癌症病人死后尸检时观察到了CTC的存在。讲基因组学的故事常常从孟德尔说起，而这篇文献但凡是想介绍下CTC历史的文章中必被小辈拱手引用。这时间可比随着医学的发展与进步，人类给癌症摘掉绝症的帽子早了一百多年。
随着CTC分离和鉴定技术的发展，对于CTC的研究再次成为肿瘤领域的焦点。FDA批准上市了cellsearch掀起了新一轮的热潮；有人对PubMed下circulation tumor cell 这一关键词检索发现2013-2015年间全球每周新文献数量在20-25篇左右。今天就带大家一起走进这个大热点。
基础篇
CTC从哪里来
循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTC） 主要来源于肿瘤组织自发脱落的肿瘤细胞或是人为操作带入外周血的肿瘤细胞。
CTC在脱离了肿瘤组织的环境后往往很脆弱，失去细胞间相互作用而发生失巢凋亡，被血液中的免疫细胞攻击致死，或者干脆觉得进了循环系统就像猫咪跳进洗衣机，被血流的剪切力给冲死了。
但是如果CTC发生了上皮间质转化，或者是形成循环肿瘤细胞团（circulating tumor microemboli，CTM） 组团外出，那么存活下来并且发生转移的概率则大大增加。
CTC与转移
肿瘤转移的机制尚有许多不清之处，有待验证，但是近年来CTC的研究揭示了CTC是恶性肿瘤患者出现术后原位复发、远端转移和浸润的重要原因。上皮间质转化则可看做是“种子-土壤”假说的现代版本。
“种子-土壤”这个名字一出，相信大家已经理解的八九不离十了。原发肿瘤组织产生“种子”，“种子”找到合适的土壤生长为新的肿瘤组织。目前研究发现上皮间质转化就是产生种子的关键一步。
上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition， EMT） ，顾名思义就是上皮细胞在形态学上发生向间充质细胞表型转变的过程。这一过程本是胚胎发育的基本过程，也是炎症反应、伤口愈合等组织修复再生时必须的。然而肿瘤细胞在一定条件下发生EMT转化就会得到新技能：迁移。
上皮细胞间连接紧密，相对稳定不可移动。间质细胞很少有细胞连接，结构松散分散于细胞外基质中。这一转化是受到严格调控的过程，基因表达的改变促使上皮细胞停止分裂，离开原本附着的基底膜，切断与周围细胞的联系，细胞骨架也发生相应的变化以增强运动能力。
CTC与病程
转移是肿瘤发展进程中的重要特征，CTC的数量与肿瘤负荷、病程发展息息相关。
这是一项针对乳腺癌病人的研究中的案例。虚线表示了影像学的评估，PD代表疾病进展，PR代表部分缓解，SD表示疾病稳定，这一评价体系是NCI、FDA等全球多家癌症研究机构推荐的实体瘤疗效评价标准。主要通过影像学方法评估瘤体大小的变化评价疗效。可以明显看到在第一个疾病缓解期，CTC水平已经上升，换药后，CTC的下降也即时反应了药物有的有效性。
据有关研究发现，CTC对于病情进展的指示作用要比影像学评估平均早6-8个月的时间，可以帮助医生及时掌握病情，调整治疗方案。
技术篇
在开始正题前，我要讲一个警匪的故事，如果你能勉强接受这个不完备的假设，或许对于理解CTC的技术有一点点帮助。
人体的内部仿佛其实很像一座城池，循环系统就是承载它运转的交通系统，里面跑着的红细胞像运输员，数量极为庞大；白细胞像治安官负责抓坏蛋。城市总有黑暗面，而肿瘤就是黑社会，黑恶势力的暗自成长就会影响城市正常的功能，掠夺城市运转的社会资源。黑社会一方面会扩张自己的领地，而那些小弟里面也有不甘心于此，妄图自立山头。
现在复习一下之前的内容，循环系统里面会有一些小流氓是出来闲逛的，他们比较容易被警察捕获或是其他原因挂掉。另外一些小流氓或许内心已经悄悄变化，长出了一颗王者的心，他们比较耐磋磨，条件适宜的情况下，可以另辟疆土自立门户。有一些干脆组团出发，抵御循环系统恶劣的环境。
CTC的富集
转移是肿瘤发展进程中的重要特征，CTC的数量与肿瘤负荷、病程发展息息相关。只是观测到CTC并不能作为有效的预后标准，科学的评价必须建立在CTC有效富集的基础上。CTC这种细胞计数即能反映预后的标志物，富集方法对于检测有效性的影响可想而知。然而CTC沉浸在血细胞的海洋里，CTC含量之低有如在文学巨着里面挑错别字。那么我们是如何解决这个问题的呢？
负责运输的红细胞与CTC和白细胞的个头差别比较大，分离起来不成问题。主要的难点集中在白细胞与CTC的分离上。
正向富集——正面出击，我们直接寻找到小流氓
黑恶团伙总会带一些别人不带着的东西，比如举着个棒子。我们用特异性寻找棒子的方法来找到CTC细胞。
最常用的棒子就是EpCAM，通过EpCAM富集是一项成熟的技术，cellsearch系统也是通过它对细胞进行分选的。
EpCAM全称上皮细胞粘附分子，是细胞膜上的一种蛋白质，正常情况下在多数上皮组织上都有所表达。而在造血系统来源的细胞、脑组织和血管内皮细胞中没有明显的EpCAM的表达，是一种特异性很好的分选方法。
负向富集——排除法，去掉不是坏人的人，剩下的就是坏人
流氓带着棍棒，当然治安官也会有一些特点比如随身携带专用电台，所以只要我们能把带手台的治安官找到，剩下的就是我们要找的CTC啦。白细胞是虽然种类繁多，但是有一点是一致的，他们都表达CD45。
CD45是一种白细胞共同抗原，是细胞之间沟通信号传导上有关键作用，在几乎所有的白细胞上都有表达。警察们互相联系的手台要保持一致嘛。
方法2，物理富集
运输员警察和小流氓的个头不一样、密度不一样、带的电荷不一样、或者流体中运动状态不一样，这些物理性质也帮助我们分选出CTC。但是这些物理方法主要针对单个的CTC，聚成团的CTC有可能在分离过程中因为物理性质与单个细胞不同而无法筛选出来。
方法3，结合着用
先负向负极去除绝大多数白细胞，再进行正向富集，可以大大提高正向富集的效率。
物理富集和生物富集结合着用，改造生物富集的物理条件也可以提高效率。
在EpCAM以外增加其他的捕获靶标分子，也可以减少因为EMT造成的CTC细胞丢失。
CTC的检测
1. 计数
对富集到的细胞进行鉴定、计数是最常规的手段。
目前的鉴定手段也是非常多的，常用的有通过细胞染色体变异来判断（FISH），或是通过细胞表面抗原免疫荧光来判断。
但是一旦落实到计数层面就会有一个小的问题，我们之前说过如果CTC是个小流氓的话，它的危害程度并不完全一致。有些难成气候，在循环系统中存活较短，不会四处兴风作浪。然而另一些则怀揣开疆僻壤之心，自立门户，危害极大。
单纯的通过肿瘤细胞的一些特性只是鉴定了肿瘤细胞，而将这两类细胞一概而论，或许并不是一个理想的选择。
2.q-PCR
撬开CTC的外壳，发现他们真实的状态，或许是一种有效的方式。
研究发现，CTC在表达上皮细胞基因的同时，表达类似干细胞及上皮间质转化的基因，这些基因的表达对肿瘤患者的预后评估有更为精准的临床意义。
在对转移性结直肠癌患者的研究中发现，高水平表达CK20或高水平表达Survivin的患者的总生存期分别是9个月和10个月，与CK20和Survivin表达水平都低的患者总生存期（33.2个月）相比，总生存期明显下降。
CTC-CK20或CTC-survivin其中任一个标记物在转移性结直肠癌患者中的表达水平的高低都是对其总生存期最强的预测因子，而对于二者的综合评价，会对患者的预后有更全面的评估。
细胞角蛋白CK家族是上皮性肿瘤较特异的免疫组化标志物，CK19和CK20是肿瘤组织免疫组化中常用的标志物。survivin是细胞凋亡的抑制分子，因其有利于细胞存活而得名“存活素”，正常情况下仅在胚胎和发育中的胎儿组织中出现，终末分化的成人组织中一般没有表达。
然而上皮间质转化这一与复发转移风险高度相关的过程，会使细胞部分丢失或全部丢失上皮细胞的特征。因此这一过程通路上重要基因的表达结合干细胞标志物ALDH1也是我们评估复发转移风险的指征。
高灵敏度的qPCR加上合理选择的marker基因，是对CTC细胞的精细刻画。让我们不只是清点数量，而是在一众举棒子的小流氓中可以判断他们的搞事情的能力到底有多高。
CTC检测的应用
何时应该进行CTC检测呢，其实在治疗的任何时期都可以切入，对病程达到动态监测的目的。其中最具直观检测意义的还是在与疗效评估，术前术后或化药/靶药用药前后，无论疗效评估还是复发风险判断，对于患者的治疗都是非常重要的。
癌症治疗手段日益丰富，已被视为慢性病的当下，CTC就是癌症慢病管理的重要手段，从细胞层面了解肿瘤发生发展情况，早于影像学评估及时调整治疗方案，帮助患者争取时间尽早调整治疗方案，才能有更好的带瘤生存。
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