精子DNA完整性对囊胚形成时间及形态的影响！

育龄期夫妇中不孕症的发生率约15%，而在试图怀孕的人群中，不孕症发生率高达25%，且随着年龄的增长而增加。其中男性不育在不孕症影响因素中约占50%。导致男性不育症的因素包括遗传、解剖异常、精索静脉曲张、内分泌紊乱、全身性疾病、感染、免疫、环境毒性、生活方式、放化疗和药物治疗等。精液常规分析是诊断男性因素性不孕症的首选评估方式和主要参考依据，其通过精子数量、活力和形态评估男性生育力，帮助临床选择合适的助孕方式。但除了数量、活力和形态的异常外，精子内还可能存在遗传物质的缺陷，如染色质成熟异常、表观遗传修饰改变、DNA碎片、非整倍体和Y染色体微缺失等。

精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay，SCSA) 是评估精子DNA碎片和染色质成熟的一项常用检测技术，由Evenson等在1980年提出。精子DNA受氧化应激、凋亡不完全等原因的影响，发生DNA单链或双链的断裂，受损的不成熟精子染色质因为二硫键的缺乏，形成松散结构的染色质，在热或酸变性条件下，会变性成单链。吖啶橙(acridine orange，AO)可与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光，与单链 DNA 结合呈聚合物形式，发出红色荧光。流式细胞仪检测获得红色荧光与总荧光的比值，定义精子DNA碎片指数 (DNA fragmentation index，DFI)，以此判断精液中精子DNA碎片率。此外，当组蛋白与鱼精蛋白缺乏充分交换，DNA与AO的结合度会增加，导致绿色荧光增强，这种DNA高染色性 (high DNA stainability，HDS) 精子占总精子数的比例，代表精液中未成熟精子含量，即精子染色质成熟度。

精子DNA碎片检测在评估不育男性中的常规临床应用仍存在争议。世界男性健康杂志的指南提出，对有不明原因和特发性不孕症、复发性流产、精索静脉曲张、辅助生育反复失败、有生活方式/环境危险因素的患者，检测精子DNA碎片较为有效。但精子DNA碎片对男性生育力、妊娠和辅助生育结局的潜在预测价值，目前仍然缺乏足够的证据。

囊胚培养和移植已越来越多地应用于辅助生殖技术(ART)中。囊胚形态学分级系统是ART中最被接受和应用最广泛的移植前囊胚质量评价和选择方式，它是基于囊胚的扩张程度、内细胞团(inner cell mass，ICM)和滋养外胚层(trophectoderm，TE)细胞的形态特征。研究证明，囊胚形态与着床率、临床妊娠率、持续妊娠率、活产率均有显著相关性，且第5天囊胚的着床率、临床妊娠率和活产率明显高于第6天囊胚。本研究旨在探讨SCSA检测的精子DFI和HDS是否影响囊胚形成时间及形态分级，分析其对ART治疗结局的潜在影响，从而为精子DFI和HDS在ART临床规范和男性生育力诊疗中的应用提供理论参考。

研究回顾性分析2016年5月至2022年9月因单基因疾病来北京大学第三医院生殖医学中心接受辅助生殖技术治疗的242例患者临床资料，共有1167枚囊胚。根据囊胚形成时间分为D5囊胚和D6囊胚，再根据囊胚的内细胞团和滋养外胚层细胞形态学，各分为A、B、C三个等级，分别对各组囊胚的临床资料进行比较，分析不同形成时间及形态分级囊胚间的精子DNA完整性的差异；利用Logistic回归分析精子DNA完整性对囊胚形成时间和质量的影响。

结  果

一、D5囊胚和D6囊胚两组间的基本情况

本研究共纳入1167个囊胚，包括244个D5囊胚和923个D6囊胚。两组间女方年龄、FSH水平、E2水平、前向运动精子率、精子正常形态率和HDS比较均无显著差异（P>0.05）；与D5囊胚组相比，D6囊胚组的男方年龄和精子DFI水平显著升高，而AMH水平、AFC、精子浓度均显著降低

二、不同内细胞团和滋养外胚层细胞分级囊胚之间的比较

与内细胞团B级囊胚相比，内细胞团C级囊胚组的AMH和AFC显著降低（P＜0.05），内细胞团A级囊胚组的精子正常形态率显著升高（P＜0.05）；夫妇双方年龄、FSH水平、E2水平、精子浓度、前向运动精子率、DFI和HDS在3组内细胞团分级的囊胚之间无显著差异（P>0.05）（表2）。

与滋养外胚层细胞C级囊胚相比，滋养外胚层细胞A级囊胚组的精子浓度和正常形态率显著升高（P＜0.05），滋养外胚层细胞A级和B级囊胚组的精子DFI显著下降（P＜0.05）；夫妇双方年龄、FSH、E2、AMH水平、AFC、前向运动精子率和HDS在3组滋养外胚层分级的囊胚之间无显著差异（P>0.05）（表3）。

三、多因素回归分析精子DFI和HDS对囊胚形成时间和形态质量的影响

Logistic回归分析纳入混杂因素女方年龄、男方年龄、FSH、E2、AMH水平、AFC、精子浓度、前向运动精子率和精子正常形态率。结果显示，精子DFI影响囊胚形成时间，显著增加D6囊胚的概率[OR=1.017，95%CI(1.001，1.033)，P=0.047]；AFC[OR=0.973，95%CI (0.949，0.998)，P=0.036]和精子浓度[OR=0.996, 95%CI(0.992，1.000)，P=0.048]也是囊胚形成时间的独立影响因素。同样，精子DFI影响囊胚质量，增加非优质囊胚的发生[OR=1.017, 95%CI(1.004, 1.029)，P=0.010]；前向运动精子率也是囊胚质量的独立影响因素[OR=1.009，95%CI(1.001, 1.017)，P=0.032]。精子HDS对囊胚形成时间和囊胚质量均无显著影响（P>0.05）（表4）。

讨  论

DNA链断裂是精液精子中最常见的遗传物质异常。过去的近30年里，精子DNA碎片成为男性不育症的研究热点之一。特别是在1993年Gorczyca等提出，在异常的人类精子细胞中，DNA链断裂和DNA原位变性的敏感性增加，这引起了人们对精子DNA碎片的关注，尤其是精子DNA碎片对男性生殖功能和其子代健康的影响。然而，精子DNA碎片是否会影响胚胎植入、临床妊娠、流产与活产，目前仍存在争议。

本研究纳入的研究对象是因单基因疾病来我生殖医学中心就诊的夫妇，在其诊疗常规中，所有患者均行ICSI方式授精，排除了因常规精液质量而选择IVF/ICSI助孕方式的偏倚。另一方面，因为要行胚胎染色体核型分析和致病基因的检测，所有胚胎均培养至囊胚，且在活检前进行形态学评估，排除了因其他因素是否选择囊胚培养而产生的偏倚。因此，该数据分析能够较为准确地评估精子DNA完整性与囊胚形成时间和形态分级之间的相关性。

在动物模型的研究中，较多证据证明，当卵母细胞与DNA受损的精子结合形成胚胎后，胚胎的第一次卵裂延迟。也有研究报道，受辐射损伤的精子受精后，胚胎从受精后第2.5~4天的分裂延迟，延迟开始的时间与照射剂量有关，照射剂量越高，精子损伤程度越大，分裂延迟开始的时间越早。

Esbert等利用年轻供卵人群结合胚胎实时成像技术的研究发现，高水平的精子DNA碎片可以延迟胚胎分裂。因此，精子DNA损伤可能在一定程度上会延迟囊胚的形成时间。有研究证明，相比D6囊胚，D5可用囊胚的着床率、临床妊娠率和活产率显著升高。本研究结果显示，D6囊胚组的精子DFI著高于D5囊胚组，多因素回归分析显示精子DFI是囊胚的形成时间的独立影响因素（OR=1.017），这提示精子DNA碎片可能通过延迟胚胎发育影响胚胎质量，从而影响ART的临床结局。

虽然精子DNA碎片在常规ART治疗结局的预测作用还不明确，但多数研究和荟萃分析证明，精子DNA碎片与复发性流产存在显著相关性。与生育能力正常的夫妇相比，有反复流产史夫妇的男性精子DNA碎片率显著升高。胚胎染色体非整倍性目前是人类生育的主要限制因素之一，约占早期流产原因的50%。囊胚形态与胚胎染色体整倍性存在显著相关性，形态评分高、形成时间快的囊胚，染色体异常的发生率较低。

多项研究结果证明，囊胚形态分级与ART的着床率、临床妊娠率、持续妊娠率、活产率均呈显著正相关。即使利用植入前诊断技术选择染色体核型正常的胚胎移植，较高形态评分的囊胚移植后的妊娠率和活产率也显著高于形态评分较低的囊胚。因此，囊胚形态在一定程度上反映了胚胎移植后的临床结局。目前关于精子DNA碎片对囊胚形态影响的研究报道较少。本研究结果显示，精子DFI是囊胚滋养外胚层细胞分级和囊胚整体质量的危险因素之一。本研究中，虽然内细胞团C级囊胚组的精子DFI水平高于内细胞团A级和B级囊胚组，但未见统计学差异（P>0.05）。Baatarsuren等认为，与内细胞团质量相比，滋养外胚层细胞更能预测活产率。

精子HDS参数表示由于精子染色质中组蛋白与鱼精蛋白缺乏充分交换，组蛋白复合物DNA与AO的结合程度高于鱼精蛋白复合物DNA，从而使得该类精子的绿色荧光增强，较高绿色荧光精子的比例代表了样本中的未成熟精子的含量。HDS的检测通常与精子DFI检测同时进行，DFI是随着男性年龄的增长而增加，与精子浓度、活力呈显著负相关，而HDS是随着男性年龄的增加而降低。高HDS水平的精液样本可能导致早期胚胎生长停滞和流产。但仍有研究结果显示，HDS并不影响ART助孕结局。本研究结果显示，精子HDS不是囊胚形成时间、内细胞团和滋养层分级的独立影响因素。

综上所述，本研究利用单基因疾病的患者人群，探讨精子DNA完整性对囊胚形成时间和囊胚形态分级的影响，分析结果显示精子DNA碎片升高可能会延迟胚胎发育，影响胚胎质量，而精子HDS对胚胎发育和质量未见显著影响。因此推测，精子DNA碎片对辅助生殖技术助孕结局可能有一定程度的影响。该研究为精子DNA碎片检测技术在男性生育力诊断和辅助生育临床治疗中的应用提供了一定的理论参考，但相关分子机制还有待进一步研究。

文章来源：

高江曼，魏楠，王媛媛，闫丽盈，乔杰，洪锴.精子DNA完整性对囊胚形成时间及形态的影响[J].生殖医学杂志，2023,32(7):977-983.