PNAS：两种基因的协同作用启发帕金森病机理研究

Synaptojanin1（SJ1），也称为PARK20，是一种磷酸肌醇磷酸酶，集中在与内吞膜运输有关的突触中。之前的研究显示，SJ1在Sac肌醇磷酸酶结构域中的失活突变（R258Q）可导致早发性帕金森氏病。有趣的是，通过全基因组关联分析发现 Sac2/INPP5F基因（另一种包含Sac结构域的蛋白质，主要起PI4P 4-磷酸酶的作用）被认为是PD的危险基因。同时，Sac2通过与Rab5的相互作用参与了内吞途径，并且像SJ1一样主要表达在神经系统中。因此，作者提出了如下假设：SJ1和Sac2的Sac结构域可能在突触内吞途径中具有一些重叠的功能。Sac2的缺失与SJ1的突变具有协同作用，引起突触内吞流的减少，Sac2可以作为PD的潜在风险基因。

近日，Pietro De Camilli课题组在PNAS上发文发现SJ1和Sac2具有协同作用，其功能障碍导致帕金森病（PD），对假设进行了进一步阐明。

Pietro De Camilli教授现为耶鲁大学讲席教授，耶鲁大学医学院神经科学系主任，Kavli神经科学研究所所长。De Camilli教授包揽了美国科学院（National Academy of Sciences）、艺术与科学院（AmericanAcademy of Arts & Sciences）和医学院（Institute of Medicine）三院院士。

Pietro De Camilli实验室致力于研究神经元突触的细胞生物学机制，对突触囊泡动力学的研究为胞吐和内吞作用的研究做出了突出贡献。他发现并描述了磷脂酰肌醇代谢在控制细胞内吞中的作用，在磷脂信号传导和膜运输领域具有广泛的意义。

1SJ1和Sac2突变对小鼠存活的影响

尽管Sac2敲除（Sac2KO）小鼠没有明显的病理神经表型，同时SJ突变敲入（SJ1 RQKI）小鼠虽然有神经功能损伤，但仍然有约60%的小鼠可以成年。但是Sac2 KO和SJ1 RQ KI交配得到的子代大多数在出生后24小时内死亡，少数存活了几天，其余的则在3周内断奶之前死亡。利用含有GFP-Sac2的慢病毒感染培养的野生型小鼠海马神经元，发现GFP-Sac2在整个神经元（包括轴突和轴突末端）中具有弥散和广泛的分布，这与SJ的表达分布相似。这些结果增加了作者对Sac2与SJ1可能具有某些重叠功能可能性的猜测。

2缺失Sac2可增强SJRQ KI神经元轴突末端内吞因子的积累

作者之前的研究曾报道过SJ1RQ KI小鼠在大脑的各个区域中都出现了非常强的内吞因子过度积累的现象。因此培养了WT，Sac2 KO，SJ1RQKI和Sac2 KO/SJ1RQ KI小鼠的皮层神经元进行了类似的分析。但是在Sac2 KO神经元的突触末端没有观察到这样的积累或聚类。而在Sac2 KO/SJ1 RQKI神经元中，两性纤维蛋白2，网格蛋白轻链（CLC），生长素和SJ1自身的积累比SJ1 RQ KI神经元明显更强，从而证实了这两个突变的协同效应（图1）。通过分别对vGAT和vGlut1进行免疫荧光检测，发现在双突变小鼠皮层神经元中抑制性突触比兴奋性突触在突触前内吞因子的积累更为明显。

图1 Sac2的缺失增强了SJ1RQ KI突触中的内吞因子的异常积累

3VC轴突末端内吞因子的积累与异常囊泡中间体的积累相关

接下来，作者进行了光学和电子显微镜（CLEM）检测，以确定内吞蛋白的聚集是否对应于内吞囊泡中间体的积累。使用SNAP标记CLC，然后将SNAP-CLC阳性区域进行处理以进行epon包埋，切片和电子显微镜（EM）分析。EM观察表明，Sac2 KO/SJ1RQ KI双突变小鼠轴突末端的SNAP-CLC荧光所显示的位置存在大量囊泡和突触。但是，这些囊泡的积累明显不同于野生型突触的真正突触小泡簇，这些囊泡之间的间隔较大，同时基质更为致密（图2）。

图2. Sac2 KO/SJ1RQ KI双突变突触前末端的小囊泡异常积累

4Sac2的缺乏会加速SJ1RQ KI神经元神经退行性病变的发生

作者检测SJ1RQ KI小鼠脑中与PD相关的E3泛素连接酶Parkin的表达，发现在3.5月龄时观察到Parkin的表达的增加，而在2.5 月龄时却没有显著的变化。但是，对2周龄的Sac2 KO/SJ1RQ KI双突变小鼠相对于WT，SJ1RQ KI或Sac2 KO小鼠，Parkin的表达显着增加。同时，在培养三周的Sac2 KO/SJ1RQ KI双突变海马神经元中也发现类似结果（图3）。

作者之前的研究通过标记酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺质膜转运蛋白（DAT）发现在1月龄的SJ1RQ KI小鼠的纹状体神经元轴突末端出现了年龄依赖的营养障碍性病变。在本研究中，作者在出生后15和19天的两只Sac2 KO/SJ1RQKI小鼠的背侧纹状体中同样检测到TH和DAT阳性的稀疏营养障碍轴突末端，表明轴突营养障碍的早期发生（图3）。

图3. Sac2的缺失加速了SJ1RQ KI神经元中神经变性表型的发生

5总结及展望

在本研究中作者揭示了两种含Sac磷酸酶结构域蛋白SJ1和Sac2的功能丧失或突变具有协同作用。虽然在SJ1的Sac结构域失活突变（SJRQKI）小鼠具有类PD的神经系统缺陷，但通常可以存活到成年，但是大多数具有SJ1和Sac2这两种突变的小鼠都具有严重的神经系统缺陷并在围产期死亡。缺失Sac2会增强SJRQ KI神经元的突触前缺陷，加速了Parkin异常积聚并提前了背侧纹状体中营养缺陷性多巴胺能轴突出现的时间。这些结果表明两种蛋白质的Sac磷酸酶结构域具有至少部分重叠的功能，同时Sac2的基因是PD的风险基因。

此外，作者猜测也有其他机制将SJ1功能与PD联系起来。例如，内啡肽负责将SJ1募集到内吞位点并与Parkin结合，内啡肽的缺失会导致parkin水平升高。实际上，内啡肽和SJ1都被parkin泛素化，并且内啡肽A1基因本身已被确定为PD的风险基因。另一方面，PD相关蛋白LRRK2（PARK8）使SJ1，内啡肽和生长素磷酸化。因此，进一步阐明这些管家蛋白的突变如何影响PD相关神经元的功能将促进我们对PD机制的理解。