单细胞RNA测序--TargetAmp法、SMART法

TargetAmp法测单细胞全RNA

Illumina旗下的EpiCentre公司开发的TargetAmp方法，可以把少量RNA（最少到1个细胞，约10pg）扩增到ng级，以达到可以进行高通量测序所需的核酸量。

1. 第一链cDNA合成

a. 用T7-Oligo(dT)的引物进行cDNA合成，以便引入一个T7启动子

2. 第二链cDNA合成

a. cDNA:RNA杂交产物中的RNA被RNase H消化，剩下cDNA单链

3. 体处转录合成aRNA

a. 利用带T7的转录启动子的双链DNA，启动体外转录生成大量aRNA

        4. 纯化aRNA

5. 第二轮的第一链cDNA合成

a. 使用随机引物，再合成一轮cDNA

6. 第二轮中的第二链cDNA合成

a. 用RNase H把DNA:RNA杂交产物中的RNA消化掉。用T7-Oligo(dT)引物合成cDNA

本方法的特点：

• 第一轮与第二轮都是线性扩增，大大减少了PCR反应的指数效应所引起的Bias(偏差)

• 高效扩增，一轮扩增可以扩增几千倍，把10pg级的Total RNA中的mRNA扩增到几个ng，达到二代测序的样本量要求。如果经过两轮扩增，就可以达到生物芯片所需的ug级的核酸量

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SMART法测单细胞的全长全RNA

单细胞RNA-seq测序，将为科学家带来巨大的研究新空间。但是单细胞RNA-seq所面对的困难也是巨大的：

1. 起始RNA只有约10pg

2. 如何保证大部分的mRNA被逆转录成cDNA

3. 如果高效地得到长全cDNA，而不是断裂的靠近poly(A)尾巴的那些cDNA

4. 如何扩增cDNA

SMART-seq方法是一种优秀的单细胞全长RNA-seq方法。

原理：

巧妙：

1. 用“带poly(T)—PCR下游扩增序列的引物”启动逆转录。这样保证了逆转录是从模板最3’端的Poly(A)位置起始，且逆转录的产物连上了一个可以PCR扩增的下游引物序列。

2. 用SMARTscribe RT酶进行逆转录，这个酶有个特点：会在转录的末端，延长出几个超过模板的C碱基。

3. 用“带3个g—PCR上游扩增序列的引物”与逆转录得到的第1链进行粘合，注意这里的3个g碱基是RNA碱基，而不是DNA碱基。这有利于引物与逆转录酶相结合，再进行延伸，把PCR扩增的上游引物序列也引入到逆转录产物中来。

4. 在上、下游都引入了PCR引物序列之后，PCR可以高效进行。

5. PCR的产物进行建库，再深度测序。

结果：

1. ５’到3’的覆盖度均一度：

从上图可以看出覆盖的均一度较好，RNA-seq中常见的3’偏向性在10pg起始RNA的条件下也不明显。

2. 检测灵敏度

10pg的起始RNA，RPKM为10的基因，有76%的被检测到的比例。这也基本是检测灵敏度的中位值

3. 单个肿瘤细胞的检测

效果接近于20pg起始RNA的效果， 约8000个基因可以被检测到

4. 与大量RNA测序得到结果对比相关性

5. 举例说明测得的reads在一个长基因上的覆盖情况

RNA polymerase II alpha是一个长达14Kb的基因，含有27个外显子。上图显示了测到Reads在各个外显子上的覆盖情况。

结论：

1. SMARTerRNA-seq方法是一个可行的单细胞RNA-seq测序方案。

参考虑资料：

Full-length mRNA-Seq fromsingle-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells

Daniel Ramsköld， Shujun Luo等

Nature Biotechnology VOLUME 30NUMBER 8 AUGUST 2012